枸杞属(Lycium L.)在全球约80种，主要分布在南美洲，少数分布于欧亚大陆。我国产地主要分布于北方，共7种3变种，包括宁夏枸杞(L. barbarum L.)、枸杞(L. chinense Mill.)、柱筒枸杞(L. cylindricum Kuang et A. M. Lu)、新疆枸杞(L. dasystemum Pojark.)、黑果枸杞(L. ruthenicum Murr.)、截萼枸杞(L. truncatum Y. C. Wang)、云南枸杞(L. yunnanense Kuang et A. M. Lu)、北方枸杞(L. chinense var. potaninii)、黄果枸杞(L. barbarum var. auranticarpum)和红枝枸杞(L. dasystemum var. rubricaulium)。

宁夏枸杞因具有抗氧化、抗肿瘤、保肝明目、增强免疫、降糖降脂等作用，是我国枸杞属7个种3个变种中唯一被载入2015版《中国药典》的枸杞物种^[1]。宁夏枸杞属于典型的异花授粉，基因杂合度高，但由于近年来枸杞繁殖多采用高度自交亲和植株及无性扩繁手段，使得枸杞品种的遗传多样性降低。宁夏枸杞在长期的栽培过程中，经自然杂交、人工杂交和筛选等不断选育出新品种，如宁杞1-7号、宁菜1号、大麻叶、小麻叶及变种黄果枸杞等，植株和枸杞子的外观形态差异较小，种和品种的形态学鉴别存在困难。由于经济利益驱动，市场上存在以形态相似的白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)等伪品冒充枸杞销售的行为。

20世纪80年代以来，分子生物学技术快速发展，人们认识到直接分析DNA序列信息，可以从根本上避免由表型性状或成分分析来鉴定种或品种时存在的问题。这种利用一个或少数几个DNA片段对物种进行识别鉴定的技术称为DNA条形码鉴别技术。rbcL基因是编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶大亚基的，该酶在光合作用及光呼吸中起关键作用。rbcL基因高度保守，常用于探索属、种间的进化关系。由于rbcL基因全长约1 400 bp，不符合标准条形码长度要求，Kress等^[2]选取了rbcL基因中变异最大，且在不同植物中具有广泛可扩增性的一段约500-600的片段，并命名为rbcL-a，作为DNA条形码。ITS序列(Internal transcribed spacer)是编码核糖体RNA的核DNA序列上的转录间隔区，处于rDNA的18S和26S之间，相对保守，作为非编码区，它承受的环境选择压力较小，即使变异也以相互独立的点突变为主，该特征使得其为属以下水平的物种研究提供了便利，具有样品用量少、鉴定精准等优点，目前被广泛应用于药用植物的鉴别^[3]。基于此，本研究拟采用分子生物学手段，利用rbcL-a及ITS分子标记对14个枸杞种或品种及其伪品白刺进行品种鉴别和遗传关系分析，为枸杞真伪及品种鉴别，枸杞各种或品种间遗传关系研究提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

供试材料收集自青海诺木洪农场的枸杞产业园区，共15份，包括宁夏枸杞的宁杞1-7号、宁菜1号、蒙杞1号和大麻叶共10个品种，宁夏枸杞变种黄果枸杞、黑果枸杞、云南枸杞和韩国枸杞各1份，枸杞伪品白刺1份(表 1)。Axygen胶回收试剂盒购买自上海研谨生物科技有限公司，质粒载体pMD18-t，大肠杆菌DH5α等均由刘谊兰博士友情赠与。

1.2 方法 1.2.1 基因组DNA的提取

利用Genstar试剂盒进行总DNA提取。

1.2.2 目的基因的克隆和测序

引物序列:通用引物^{[2, 3]}，rbcL-a F: 5'-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3'，rbcL-a R: 5'-CTTCTGCTACAAATAAGAATCGATCTC-3'；ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。

PCR反应体系(50 μL): 10 nmol/L左右引物各2 μL，20 ng/μL DNA模板10 μL，ddH₂O 11 μL，PCR Master Mix(2X)25 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR产物利用1%的琼脂糖凝胶和TAE缓冲液进行电泳检测，固定电泳功率为12 W，电泳20 min左右，Goldview染色。PCR阳性产物送美吉生物公司进行双向测序。

1.2.3 T克隆检测

对于无法顺利测通的ITS序列，将其扩增产物利用Axygen胶回收试剂盒进行回收，4℃过夜连接pMD18-t载体，转化E.coli DH5α，37℃培养，12 h后挑取单克隆，经PCR验证阳性后美吉生物公司测序。

1.2.4 序列分析及构建系统发育树

将测序结果进行拼接，利用NCBI，将枸杞rbcL-a和ITS序列与已发表相关属种植物序列分别进行BLAST同源比对，确定序列边界。运用Clustal X软件对不同材料的序列进行对位排列，并进行人工矫正。利用在线软件RNAfold WebServer(http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/Bioinf4/miRNA/miRNA1.htm)计算5.8S区的最小自由能，并利用MEGA5.0软件进行序列长度、GC含量及多态性位点的统计分析。最后采用非加权组平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)构建系统发育树。

2 结果 2.1 rbcL-a序列扩增及测序结果

利用rbcL-a通用引物对15份供试材料的总DNA进行PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 1所示。对以上PCR产物进行测序，测序结果为:白刺和枸杞样品的rbcL-a序列全长均为643 bp，其中14种枸杞的rbcL-a序列完全一致，白刺与枸杞的rbcL-a序列共有45 bp的碱基差异。序列比对结果如图 2所示。

2.2 ITS序列扩增

利用ITS通用引物对15份供试材料的总DNA进行PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 3所示。对以上PCR产物进行测序，其中编号为4、5、7、8、9、10、12、13和15可成功测序。样品编号为1、2、3、6、11和14的6份样品存在PCR产物测序无法测通或套峰等现象。为得到这6个样品的ITS序列，进一步通过T克隆技术进行ITS序列扩增和测序。

2.3 T克隆检测

样品1、2、3、6、11和14存在套峰而无法成功测序，初步分析可能是样品间交叉污染。但重新采集样品、提取DNA、扩增ITS序列并测序仍存在套峰问题。因此，决定采用T克隆技术进一步研究。将样品1、2、3、6、11和14扩增得到的ITS序列切胶回收、连接T载体并转化大肠杆菌培养，每个样品挑选≥10个单菌落，并将PCR阳性菌送测序。测序显示大部分样品可成功测序，但也存在高级结构、重复序列及结合问题等导致测序失败。样品1共有11个克隆成功测序，样品2共有10个克隆成功测序，样品3共有6个克隆成功测序，样品6共有10个克隆成功测序，样品11共有9个克隆成功测序，样品14共有8个克隆成功测序(表 2)。

2.4 ITS序列分析

对成功测序的所有样品ITS序列进行比对及分析，发现4、5、8、9、10、12、13和15这8个样品的ITS序列完全一致，序列全长681 bp，其中ITS1长269 bp，ITS2长258 bp，5.8S长154 bp，GC含量分别为65.5%、67.3%、69.4%和55.8%。样品7为韩国枸杞，与以上枸杞品种ITS序列在ITS2区仅存在1个碱基的缺失。样品1、2、3、6、11和14的ITS序列则较为复杂，其ITS序列全长范围为513-694 bp，平均全长为620.4-684.8 bp。

所有样品ITS序列长度及GC含量具体数据见表 2。样品1(白刺)的序列全长范围为618-624 bp，平均长620.4 bp，GC含量范围为57.9-58.4%，平均为58.3%；所有枸杞样品的ITS序列平均全长在628.4-684.8 bp，平均GC含量范围为62.2-65.6%。这些ITS序列中5.8S区域长度较为保守，均为一段长154 bp的序列，但样品2存在两个长度分别为142和15 bp的序列。

在6个样品中均发现个体植株内的ITS序列多态性。5.8S区的插入缺失、二级结构最小自由能、序列的GC含量变化等可以帮助判断ITS假基因的存在。因此，进一步利用在线软件分析了每一条ITS序列5.8S区的最小自由能(表 3)，最小自由能越低表明序列越不稳定，更可能为假基因。由表 3可知，样品2的单克隆s2-2和s2-9最小自由能分别是33.1和0.4，明显低于其他序列，其5.8S序列出现了12 bp和139 bp的大片段缺失，推测这两条序列为ITS假基因的可能性较大。

进一步对较为复杂的样品1、2、3、6、11和14进行ITS序列长度及差异位点分析。由表 3可知，6个样品中均存在极高水平的个体植株内ITS序列多态性。其中白刺序列全长为618-624 bp，差异位点为25 bp，黑果枸杞序列全长为513-694 bp，差异位点高达121 bp，黄果枸杞、云南枸杞及宁杞亦存在较大的序列长度差异和位点差异。

2.5 基于ITS序列信息构建系统发育树

利用UPGMA法构建基于ITS序列的系统发育树，共72条ITS序列，包括PCR产物成功测序的9种样品ITS序列及单克隆成功测序的6种样品63条ITS序列。系统发育树如图 4所示，除个别序列外，大部分ITS序列聚类符合样品信息。所有样品序列共聚集为3大枝，分别为白刺，黑果枸杞和宁夏枸杞。白刺与枸杞分属于不同属，由图 4可见，所有白刺ITS序列聚为一支，很好的与所有枸杞序列分开；黑果枸杞ITS序列完全聚为一支，仅云南枸杞的4号序列由于ITS1和ITS2序列中的部分缺失和突变，与黑果枸杞聚在一起；此外，可以看到大麻叶、宁菜一号、蒙杞一号及黄果枸杞等宁夏枸杞的不同品种或变种与宁杞一至七号聚为一大支，而云南枸杞和韩国枸杞也聚为此类，说明宁夏枸杞与云南枸杞、韩国枸杞具有较近的遗传进化关系。以上结果表明，ITS序列虽然存在较大程度的变异，甚至出现假基因，仍可以在一定程度上较为准确地反映枸杞及其伪品的差异，以及不同枸杞品种间的系统发育关系。

3 讨论 3.1 基于rbcL-a和ITS序列的枸杞鉴别

rbcL作为编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化/加氧酶大亚基的表达基因，具有较高的保守性，而其中rbcL-a因其变异较大，在不同植物中具有广泛可扩增性而成为进行物种鉴别及物种进化关系分析的有利工具。张利民等^[4]利用rbcL-a标记对13种苔藓植物进行研究，该标记能够明确区分作为外类群的毛地钱(Dumortiera hirsuta)，构建的13种苔藓类植物的聚类结果与形态学分析结果一致。本研究中利用rbcL-a标记进行枸杞及其伪品白刺的鉴别，能够很好地区分白刺和枸杞。但由于枸杞栽培历史悠久，所有枸杞rbcL-a序列完全一致。因此，rbcL-a标记仅能用于枸杞与其伪品的鉴别，而无法应用于枸杞属内种及品种的鉴别及亲缘关系分析。

由于ITS标记为转录间隔区，在种及品种间存在一定变异，常用于进行种或品种的鉴别。顾选等^[5]利用ITS序列结合产地和形态分析，成功对黑果枸杞及其混伪品小檗科小檗属植物喀什小檗(Berberis kaschgarica)进行鉴别。本研究中也成功利用ITS序列进行了枸杞与其伪品白刺的真伪鉴别。

此外，尹跃等^[6]利用SRAP和SSR分子标记对35个枸杞品种进行鉴别，结果表明，单一引物对最多仅能进行3-14个品种的鉴别，SSR引物对的最大鉴别率要高于SRAP。这表明，由于许多枸杞品种采用无性繁殖，很多品种间基因差异较小，造成了单一分子标记鉴别的难度。本研究发现枸杞种内ITS序列高度多态性、假基因的存在以及宁夏枸杞不同栽培品种间ITS序列完全一致，这些问题使得仅利用ITS序列对枸杞属内种或品种进行鉴别的不易。

3.2 枸杞ITS序列假基因

ITS序列在高等植物基因组中高度重复，因不等交换、基因扩增和转换等方式发生位点间的致同进化，从而使得不同的ITS序列拷贝渐趋一致或完全一致，这是其作为DNA条形码候选序列的重要原因。但由于高度重复，进化过程中部分序列会发生功能缺失突变，如插入、缺失或者移码造成无法正常编码而形成假基因；或者mRNA转录物反转录为cDNA后随机整合入基因组，且经历长期进化后因随机突变积累而形成假基因^[7]。近年来，在许多植物中均发现了ITS假基因的存在。马长乐等^[8]详细介绍了栎属中ITS假基因的曲折发现过程。2003年，Bailey等^[9]在栎属的系统学研究中发现了ITS假基因的存在，对采用ITS序列做进化分析和同源基因致同进化的假设提出了挑战。研究发现，在山茶属中，基于形态学特征及使用ITS序列构建的系统发育关系存在明显冲突^[10]。徐颖等^[11]认为可能是由于ITS拷贝的多态性。范文等^[12]对1个疑似香港红茶样品进行ITS序列扩增，从同一株植物的基因组中扩增得到了74种不同的ITS序列，其中76%为ITS假基因，显示出了高度的多态性。

本研究在白刺中检测到ITS基因的多态性。范文月^[13]在内蒙古西部的白刺样品中同样检测到ITS基因的多态性，推测该现象是由于白刺物种间广泛杂交或较强基因渐渗引起的。目前，虽然在不同枸杞种或品种中检测到显著的ITS序列变异，但尚没有明确的同一枸杞植株中存在ITS假基因的报道^[14-17]。这可能是由于选择枸杞材料差异、实验技术方法不同导致。本研究共采集分析了14种枸杞样品的ITS序列，其中5份样品中发现了个体内ITS多态性。为排除DNA污染干扰，除对利用叶片进行DNA提取外，进一步采用种子萌发嫩芽进行DNA提取及ITS序列扩增，确认实验结果的准确性。枸杞ITS假基因的首次发现，是对简单利用ITS序列单一分子标记进行枸杞属植物系统进化关系分析的一个提醒。

3.3 基于ITS序列的枸杞遗传关系分析

由于枸杞栽培历史悠久、资源引种和驯化手段多样，为典型的异花授粉致使种间杂交现象普遍，导致品种多命名乱等现象，因此，借助现代分子遗传技术开展种质资源评价、遗传关系分析十分必要。石志刚等利用ITS序列分别分析了3种枸杞和宁夏枸杞种下18个品种的遗传关系，结果表明ITS序列长度变异范围为559-634 bp，能够在一定程度上对枸杞资源的整理和分类有所帮助^[17]，其研究发现，宁夏黄叶、品种88028、宁杞2号和百花聚为一支，而宁夏黄果、品种88024、圆果、尖头圆果、白条、类黄叶、品种240、大麻叶、宁杞1号、小麻叶、品种9001和不育系聚为另一大类。李小刚等^[18]借助ITS序列对10种枸杞属植物进行了亲缘关系研究，发现宁杞3号、宁杞7号、宁杞5号、扁果枸杞、蒙杞1号和品种0901聚为一支，而野生黑果枸杞、品种07-2、宁杞4号及宁杞1号聚为一支。结合本研究聚类分析，可见各聚类结果具有差异，进一步说明由于ITS假基因的存在，可能造成聚类分析结果的较大差异。因此，利用ITS序列作为分子标记对枸杞属植物进行遗传进化分析时，应考虑假基因的存在，对进化关系分析结果采取慎重态度。未来工作中，我们将加大枸杞品种及样品量，对其ITS假基因及其遗传信息进行更为广泛的研究。

4 结论

分子标记rbcL-a可用于区分枸杞属及其伪品白刺。在14种枸杞材料中有5种在单个植株内发现ITS序列的高度多态性，并首次报道了枸杞中ITS假基因的存在。基于ITS序列构建系统发育树，白刺单独聚为一支，黑果枸杞聚为一支，宁杞各品种聚为一支，该聚类结果与植物学分类较一致。