结肠癌是人类高发恶性肿瘤之一，其发病率一直呈上升趋势，全球每年患结肠癌的病例超过100万人^[1]。目前，结肠癌的治疗手段以手术治疗为主，辅以化疗、放疗等治疗手段，针对结肠癌的常用抗肿瘤药物包括5-Fu（5-氟尿嘧啶）、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨等^[2]，但术后肿瘤易复发，且副作用不容忽视。近年来，基因治疗药物、免疫治疗药物等靶向治疗药物得到了快速发展^[3]，为结肠癌的治疗开辟了新途径。

分子靶向治疗是以肿瘤细胞过度表达的分子作为靶位，选择针对性的阻断剂，能够作用于肿瘤细胞生长、运动等的信号传导通路或诱导免疫因子识别并消灭肿瘤细胞等途径，从而使肿瘤细胞生长变慢或者发展停止^{[4, 5]}。研究发现，在胃肠道肿瘤发生发展的过程中，胆囊收缩素2型受体（CCK2R）在肿瘤细胞中的表达显著高于正常细胞，在部分结肠癌、大肠癌、胃癌细胞系中的过表达更加突出^[6-9]，是结直肠癌诊断和治疗的理想靶点。

本研究根据结肠癌与正常组织表面CCK2R数量与亲和力的巨大差异，利用基因工程技术构建新型重组毒素rCCK_96-104PE38，即截取全长CCK的第96-104号氨基酸，反向重组后作为导向单元与具有高效细胞毒性的PE38（绿脓杆菌外毒素）结合，获得可以靶向高效杀伤结肠癌细胞的分子药物，并通过结肠癌体内体外实验探索其靶向特性，为临床前试验奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂

Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ、低分子量蛋白Marker、DL2000核酸Marker、pMD-18T Kit、T4连接酶均购自日本TaKaRa公司；胶回收Kit、质粒小提Kit购自美国Axygen公司；卡那霉素、氨苄青霉素、IPTG购自北京鼎国公司；Ni-NTA亲和层析介质、Tricorn 10/150玻璃柱购自瑞典GE公司；rTEV酶购自北京索莱宝公司；胎牛血清、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；荧光染料Dylight 488，HRP标记羊抗鼠IgG抗体购自上海艾博抗公司；PE38单克隆抗体3B9为本实验室制备；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.1.2 质粒、菌株、细胞、裸鼠

pET-28a质粒购自德国Novagen公司；pET-rG17PE38重组质粒、感受态BL21（DE3）PLysS、感受态DH5α、人肝细胞LO2、大肠癌细胞系SW116、结肠癌细胞系HCT8、SW620、SW480均为本实验室保存，裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.2 方法 1.2.1 rCCK_96-104PE38原核表达菌株的构建 1.2.1.1 引物

以本实验室构建并保存到pET-rG17PE38为模板，利用PCR方法将反向的CCK96-104片段基因与PE38基因进行融合，并引入了rTEV酶特异性切割位点，人工合成引物为：

F1：5' -TTCGACATGTGGGGCATGTATGACCATATGGCCGAAGAGGGC-3' ，

F2：5' -GCTAGC GAAAACCTGTATTTTCAGGGCTTCGACATGTGGGGCATG-3' ，

R：5' -GGATCCTTACAGCTCGTCCTTCGGCG-3' ，其中，下划线分别为Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点。

1.2.1.2 原核表达载体的构建

将PCR产物与pET-28a质粒分别进行双酶切，然后通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切效果，并使用胶回收试剂盒回收目的基因和载体片段，使用T4连接酶水浴16℃过夜连接，连接产物转化到BL21（DE3）PLysS感受态细胞中。

1.2.2 重组毒素rCCK_96-104PE38的表达与鉴定 1.2.2.1 低温诱导表达

将重组菌按1:100的比例接入LB培养基（Kana 50 ng/mL）中，于37℃ 7，1.5 h后，将培养箱温度降至16℃ 6将培养箱温度IPTG至终浓度0.1 mmol/L，摇培18 h。

1.2.2.2 Western blot鉴定

将表达的rCCK_96-104PE38重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，再通过电转仪转移到PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜后，先后加入PE38的单克隆抗体3B9（本实验室制备），和HRP标记羊抗鼠IgG二抗。最后加入ECL化学发光显色液显色呈像。

1.2.3 重组毒素rCCK_96-104PE38的纯化 1.2.3.1 Ni-NTA亲和层析

使用ÄKTA蛋白纯化仪进行纯化。首先用5-10个柱体积的Ni-NTA亲和层析平衡缓冲液Buffer A（50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，10%甘油，pH7.0）充分平衡Ni-NTA亲和层析柱；将超声上清注入缓慢注入层析柱，再用洗脱缓冲液Buffer B（50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，10%甘油，pH7.0）调节混合液咪唑浓度按梯度洗脱下目的蛋白。

1.2.3.2 rTEV酶切除组氨酸标签

加入rTEV酶对组氨酸标签切割，再通过Ni-NTA亲和层析获得切割标签后的目的蛋白。

1.2.4 重组毒素rCCK_96-104PE38体外抑瘤实验 1.2.4.1 rCCK_96-104PE38体外肿瘤细胞杀伤活性检测

将对数生长期的HCT116细胞以及人肝细胞LO2分别经胰酶消化后，以5×103个细胞/孔铺在96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后加入终浓度为2 000 ng/mL的rCCK_96-104PE38，用CCK-8试剂盒测定不同时间点重组毒素对肿瘤细胞的抑制率。

1.2.4.2 受体免疫荧光检测

在培养好的HCT116细胞中加入4%多聚甲醛固定30 min；5%胎牛血清封闭30 min；加入终浓度为2 000 ng/mL rCCK_96-104PE38KDEL重组蛋白，37℃孵育10 min，再先后孵育PE38单抗和荧光二抗，通过荧光显微镜观察。

1.2.4.3 肿瘤抑制率测定

在对数生长期的人正常肝细胞、结肠癌细胞系HCT116、HCT8、SW620、胃癌细胞系BGC823、黑色素瘤B16、宫颈癌细胞系HeLa中，加入不同浓度的rCCK_96-104PE38重组蛋白，孵育48 h后，使用CCK-8试剂盒测定肿瘤抑制率及IC₅₀值。

1.2.5 重组毒素rCCK_96-104PE38动物体内抑瘤实验 1.2.5.1 免疫缺陷鼠肿瘤模型的建立

取1×10⁷个HCT116细胞溶于200 μL生理盐水中，用注射器注入裸鼠右前肢腋下。7 d后观察小鼠注射部位是否出现肿块。

1.2.5.2 rCCK_96-104PE38治疗肿瘤模型

选取肿瘤体积达到50-100 mm³的肿瘤模型小鼠30只，平均分成6组，G1组：每日每只注射200 μL生理盐水；G2组：每日每只注射5 mg/kg rCCK_96-104PE38；G3组：每日每只注射10 mg/kg rCCK_96-104PE38；G4组：每日每只注射20 mg/kg rCCK_96-104PE38；G5组：每日每只注射10 mg/kg奥沙利铂；G6组：每日每只注射10 mg/kg奥沙利铂和10 mg/kg rCCK_96-104PE38。注射方式为尾静脉注射，连续注射14 d，治疗结束后将小鼠处死，记录瘤重、瘤体积，体重等指标。

2 结果 2.1 rCCK_96-104PE38重组毒素的表达与鉴定结果

如图 1所示，经10% SDS-PAGE电泳分析，诱导后的重组菌株在40 kD附近表达重组蛋白，与设计的rCCK_96-104PE38大小相符。Western blot结果表明，该重组蛋白能与PE38抗体特异性结合。

2.2 Ni-NTA亲和层析纯化结果

经10% SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果（图 2）显示，在300-450 mmol/L咪唑浓度下，重组蛋白rCCK_96-104PE38被洗脱下来。

2.3 肿瘤抑制曲线

如图 3所示，在培养基中加入rCCK_96-104PE38后，结肠癌细胞HCT116迅速凋亡，其致凋亡速率与PE毒素相近，而对人正常肝细胞没有显著影响；而PE毒素不仅能杀死肿瘤细胞，也能够致死正常的肝细胞，显示出对真核细胞的广谱杀伤性。

2.4 rCCK_96-104PE38在靶细胞上的定位

通过间接免疫荧光实验，发现rCCK_96-104PE38重组蛋白能够特异性的吸附在结肠癌细胞HCT116表面，而在肝细胞LO2上检测不到强的绿色荧光；PE毒素在HCT116及LO2细胞上均有结合，见图 4。

2.5 rCCK_96-104PE38对不同细胞的抑制效果

通过CCK8法测定不同浓度的重组蛋白对不同细胞的抑制率，并使用SPSS统计分析软件计算获得相应的IC50值（半抑制浓度）。如表 1所示，rCCK_96-104PE38对结肠癌细胞系的抑制效果最好，对胃癌细胞BGC823也有一定的作用，而对黑色素瘤B16、宫颈癌HeLa、人肝脏细胞LO2均没有显著抑制效果，与预期相符。

2.6 毒性测试

裸鼠模型在单次注射30 mg/kg时即出现中毒现象，当剂量增加到60 mg/kg时有小鼠出现死亡（表 2）。

2.7 体内抑瘤效果

以不同剂量的重组毒素和常规药物对结肠癌裸鼠模型进行治疗发现，20 mg/kg的rCCK_96-104PE38能够显著抑制肿瘤的生长，与常规化疗药物奥沙利铂联合给药的抑瘤效果最好，见图 5。

3 讨论

重组免疫毒素是一种融合了靶向分子和毒素的人造蛋白，根据靶向分子的不同主要分为两类，一类是融合了靶向某种特异性受体的天然配体，一类是融合的抗体或单链抗体^{[10, 11]}，本研究的rCCK_96-104PE38重组免疫毒素就属于第一类重组免疫毒素，具有特异性靶向杀伤结肠癌肿瘤细胞的能力。

PE毒素，即绿脓杆菌外毒素，由638个氨基酸构成的一个单链多肽，属于双组分AB毒素家族^[12]。PE毒素的优势在于，普通人体内没有PE毒素的预存抗体，而且PE毒素不仅毒性强，而且毒性机理研究已经很清楚，便于进行编辑改造及活性表达^{[12, 13]}。通过将PE分子非特异结构域1-252位和365-380位的氨基酸残基去除，得到了38 kD大小的PE38，具有更低的免疫原性，同时，将PE38羧基端的REDLK突变为KDEL，能够使细胞毒性提升6-10倍^{[14, 15]}。

胆囊收缩素（CCK）是由十二指肠和近端盲肠的Ⅰ型肠内分泌细胞和大脑神经元合成分泌，其主要生理功能是刺激胰腺分泌、胆囊收缩、抑制胃酸分泌，产生饱腹感等^[16]。CCK发挥作用均与CCK2R（胆囊收缩素2型受体）相关，而CCK2R在肿瘤细胞中过表达，因此可以将CCK作为重组免疫毒素特异性识别肿瘤细胞的识别元件^[17]。CCK在人体内以多种长短不同的分子形式存在，均为含115个氨基酸的CCK原加工剪切形成的多肽^[18]，本研究最终选择了能发挥CCK2R亲和作用的第96-104位的Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly九个氨基酸作为重组毒素的导向元件。

在测定rCCK_96-104PE38重组免疫毒素对不同细胞的抑制效果时发现，其对胃癌细胞系BGC823也有明显的致凋亡作用，原因是CCK2R不仅在结肠癌细胞上高表达，在部分胃癌细胞、部分胰腺癌中也高表达^[19-21]，进一步证实了rCCK_96-104PE38是通对CCK2R进行定位并发挥细胞毒作用。

4 结论

本实验室成功构建rCCK_96-104PE38的原核表达载体，低温诱导表达出可溶性重组毒素蛋白，并通过Western blotting验证。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化。通过体外细胞实验和结肠癌裸鼠模型体内实验证实，rCCK_96-104PE38具有靶向杀伤结肠癌的功能。