2. 中南林业科技大学林学院，长沙 410004;
3. 广东常瑞林业有限公司，广州 510900
2. College of Forestry/ Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004;
3. Guangdong Changrui Forestry Co. Ltd., Guangzhou 510900
植物组织培养再生植株是一个非常复杂的生长过程，其常受到多种体内和体外影响因子的复合调控。如培养过程中内源激素的种类及其比例关系、酶的种类及其活性变化等均对植物组织培养再生植株起着至关重要的作用[1, 2]。在植物再生体系的建立过程中，植物激素的调控作用非常明显，这在先前对其他物种的研究中均以得到证实[3-7]。但在药典品鸡血藤（Sopatholobus suberechtus Dunn）[8]的植株再生培养研究中，先前的研究仅局限在培养基与培养条件的筛选、优化等方面，而对鸡血藤再生体系建立过程中的生理学变化机理与其形态建成间关系的研究尚鲜有报道。我们拟通过研究鸡血藤再生培养过程中愈伤组织形成和分化过程中不同内源激素的含量变化，分析激素变化与鸡血藤愈伤组织发生与分化过程的关系，为鸡血藤高效再生培养体系的建立和进一步的遗传转化奠定基础。
植物内源激素的酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定已有许多报道[9-11]，但用于鸡血藤愈伤组织中内源激素的测定尚属首次。我们采用酶联免疫吸附法对鸡血藤愈伤组织发生过程中生长素（indole-3-Acetic Acid，IAA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）、玉米素（zeatin，ZT）和赤霉素（gibberellic acid，GA3）4种植物内源激素进行了分离和测定，探索出一套鸡血藤内源激素分离和测定的方法，从而为鸡血藤组织培养再生植株过程中内源激素的研究提供关键技术方法。
1 材料与方法 1.1 材料本研究以药典品豆科植物密花豆（Sopatholobus suberechtus Dunn），又称鸡血藤为研究对象。以来源于广州从化市试验基地人工栽培的鸡血藤嫩叶为外植体，在愈伤组织诱导过程中，挑选嫩叶、愈伤组织诱导时期、愈伤组织分化时期材料，每隔7 d取样一次，经液氮速冻后放入超低温冰箱（-80℃），保存待用。IAA、ABA、ZT、GA3标准品均购于Sigma公司；其余试剂均为分析纯（国药集团）；实验用水为超纯水。
1.2 方法 1.2.1 培养基与培养方法愈伤组织诱导：以MS为基本培养基，外源激素为添加NAA 0.50 mg/L、6-BA 0.9 mg/L和KT 0.2 mg/L，另外添加0.1 g/L维生素C、30 g/L蔗糖和8 g/L琼脂，pH5.8；愈伤组织分化：以MS为基本培养基，外源激素为添加NAA 0.4 mg/L、6-BA 2.5 mg/L和GA3 1.0 mg/L，另外添加8 g/L琼脂和30 g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：温度23±2℃，光照强度1 000-1 200 Lx，光照与黑暗培养时间各12 h。每批次接种30瓶，每瓶接种5块外植体。
1.2.2 样品中内源激素提取[10-13]（1）提取：准确称取样品材料0.5-1.0 g，加入2 mL提取液（80%甲醇溶液，内含1 mol/L的二叔丁基对甲苯酚），在液氮中研成粉末，转入10 mL试管，再用2 mL提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，混匀后密封置4℃条件下浸提4 h，后3 500 r/min离心8 min，取上清液，剩余沉淀加1 mL提取液混匀，于4℃条件下再提取1 h后离心并合并上清液。（2）萃取：将上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是：1 mL 80%甲醇→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5 mL）洗柱→100%乙醚（5 mL）洗柱→100%甲醇（5 mL）洗注→循环。（3）真空干燥：将过柱后的样品转入5 mL离心管中经真空干燥除去提取液中甲醇，用样品稀释液定容至1 mL，充分混匀后4℃离心，得上清液即为内源激素提取液。
1.2.3 样品中内源激素含量测定激素测定采用间接酶联免疫吸附法（ELISA）[10-13]，酶联免疫试剂盒和96孔板由中国农业大学作物化学控制实验室提供。具体操作步骤按说明书进行。
1.2.4 结果计算以最常用的Logit曲线来计算ELISA结果。Logit值的计算公式如下：
其中，B0为0 μg/L孔的显色值，B为其他浓度的显色值。测定样品根据其logit值可从图上找出其浓度所对应的自然对数，经反对数即得其激素浓度（μg/L）。进一步将样品中的激素浓度换算成激素含量（A，μg/g·fw）[12]。具体换算公式为：
式中，V2为提取样品上清液总体积；V1为经氮气吹干后上清液体积；V3为吹干后样品经稀释液定容后体积；W为样品鲜重；N为样品中激素浓度（μg/L）；B为样品稀释倍数。
所有实验及结果测定均按生物学重复进行3次。所得实验数据采用Excel和SPSS数据分析软件进行处理、绘图并进行方差及相关性分析。
2 结果 2.1 鸡血藤愈伤组织诱导过程中内源激素的动态变化为了研究鸡血藤愈伤组织诱导与培养过程中内源激素的变化特性，接种后每7 d取一次样，约14 d后鸡血藤嫩叶开始形成愈伤组织，21-28 d时愈伤组织生长处于最旺盛阶段，并继续培养到35 d时进行继代培养，采样测定各样品中内源激素含量。
结果（图 1）表明，嫩叶中的IAA水平相对较高，为1.14 μg/g，ABA含量较小，仅为0.117 μg/g，ZT和GA3的含量介于二者之间。在愈伤组织的诱导过程中，IAA的含量始终处于较高的水平，介于0.715-1.62 μg/g之间，并在愈伤组织生长最旺盛的时候（28 d）达到最大；ABA的含量一直处于最低水平，且在诱导过程中含量无明显变化；ZT含量呈现先降后升，在14 d时达到最低；GA3含量在诱导过程中呈先降后升再降的趋势。
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| 图 1 愈伤组织诱导过程中4种内源激素含量动态变化 |
同时，对4种内源激素含量间的比例关系进行了分析。从图 2可得出，IAA/ABA愈伤组织的诱导中浮动明显，表现为先降后升再降。在0-14 d呈下降，在14-28 d间表现为上升，28 d后又呈现下降。可见IAA/ABA的比值在愈伤组织的诱导与生长中起着重要的调节作用。IAA/ZT、IAA/GA3和ZT/ABA也呈现先降后升的变化趋势，但变化不明显。而GA3/ABA和GA3/ZT则在整个诱导过程中均表现为相对稳定。各激素及其间的比例关系共同调节着鸡血藤愈伤组织的生成。
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| 图 2 鸡血藤愈伤组织诱导过程中内源激素间比例变化 |
对愈伤组织分化培养过程中生长情况良好的分化组织进行跟踪与测定，对0、7、14、21、28、35和42 d的分化苗分别取样测定IAA、ABA、ZT和GA3四种内源激素的含量，通过比较和判断得出鸡血藤愈伤组织分化成苗过程中内源激素之间的关系。
测定结果如图 3，IAA含量在分化培养过程中表现为先降后升，含量介于1.15-1.87 μg/g之间，在0-21 d内呈下降趋势，在21 d后快速上升，推断得出在分化初期的不定芽诱导阶段，机体所需的IAA量不高，但在不定芽的生长阶段则需要较多的IAA来促进芽的生长。
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| 图 3 愈伤组织分化不定芽过程中内源激素的动态变化 |
ABA在分化培养过程中表现为先升后降，但总的含量相对处于较低水平，含量在0.152-0.503 μg/g之间，在分化培养初期至14 d时含量最高，可见ABA对不定芽的诱导起着极为重要的作用。
ZT在愈伤组织的分化培养过程中表现为先升后降趋势，含量的变化范围在0.651-1.12 μg/g之间。在0-28 d之间，呈现不断上升，而在后期（28 d后）处于不定芽的生长阶段，ZT含量出现了较明显的下降。可见鸡血藤在愈伤组织诱导过程中ZT含量较低，而在分化培养阶段，尤其是在不定芽的诱导中所需要的含量较高，这可能是导致ZT含量在分化培养前期出现明显上升的主要原因。
GA3在愈伤组织分化培养过程中一直表现为相对平稳的上升趋势，含量从0.548 μg/g上升到1.03 μg/g。可见，GA3的含量在愈伤组织诱导阶段的含量很低，而在分化不定芽的培养中所需的GA3的含量较高，尤其是不定芽的生成后，芽体的生长需要一定量的GA3。
同时，对4种内源激素含量间的比例关系进行了分析。从图 4可知，IAA/ABA愈伤组织的分化培养中有很大的波动，在0-14 d明显下降，在14-21 d间无明显变化，21 d后呈现大幅上升。可见IAA/ABA的比值对芽的分化与生长有着重要的促进作用。GA3/ABA和ZT/ABA也均呈先下降后上升的变化趋势，且在14 d时达到最低，而IAA/GA3、IAA/ZT和GA3/ZT则在整个分化培养过程中均呈现出一个相对平稳的态势，协同促进鸡血藤愈伤组织成功分化出不定芽。
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| 图 4 愈伤组织分化不定芽培养过程中4种内源激素含量间的比例变化 |
在鸡血藤愈伤组织的培养过程中，IAA的含量始终高于其他3种内源激素，并在愈伤组织生长最旺时和分化成芽期达到最大。ABA的含量在愈伤组织诱导阶段始终保持最低水平，但在分化培养阶段呈现明显的先升后降趋势，表明ABA含量的升高对愈伤组织的分化有明显的促进作用，这与盛艳萍等[14]的研究结果基本一致。ZT和GA3的含量在愈伤组织诱导时期保持在相对较低水平，而在分化培养阶段均呈现明显的上升，表明较高浓度的ZT和GA3有利于愈伤组织的分化。
IAA/ABA比值在愈伤组织的诱导阶段要高于分化培养阶段，说明高IAA/ABA比值有利于愈伤组织的诱导，而低IAA/ABA比值则更能有效促进愈伤组织的分化成芽，马怡迪等[15]研究者们也得出过类似的结论。IAA/ZT和IAA/GA3比值在愈伤组织的形成阶段要高于分化成芽阶段，说明高IAA/ZT和IAA/GA3比值能促进愈伤组织的形成，低IAA/ZT和IAA/GA3则更适合愈伤组织的分化。GA3/ABA比值在诱导阶段保持相对稳定，但在分化阶段则称先降后升趋势，且低GA3/ABA比值更有利于不定芽的形成。GA3/ZT在整个培养过程中整体表现为相对稳定的水平，只是在愈伤组织的诱导阶段比分化培养阶段略高。ZT/ABA在愈伤组织诱导阶段表现为先降后升并趋于稳定，而在分化培养阶段则呈先降后升趋势，且在分化培养阶段下降更为明显，表明低ZT/ABA更有利于愈伤组织分化不定芽。在后续的研究工作中，将进一步对鸡血藤愈伤组织诱导与不定芽分化过程中外源激素与内源激素间的作用关系进行深入探究。
4 结论测定了鸡血藤愈伤组织诱导与不定芽分化过程中IAA、ABA、ZT和GA3这4种内源激素的动态变化，得出适宜的内源激素浓度及其比例关系对外植体的脱分化与再分化有着明显调节作用，协同促进细胞的分裂、分化和生长。
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