2. 辽宁出入境检验检疫局，大连 116001
2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116001
布鲁氏菌病（Brucellosis）简称布病，是由布鲁氏菌侵入机体所引起的一种人畜共患传染病，人患病途径一般为接触已经感染的动物或者食物，已经成为国内乙类法定报告传染病[1, 2]。布鲁氏菌属于革兰氏阴性兼性胞内寄生菌，可以引起动物流产、不孕和人的劳动力丧失[3-5]。近年来，布病在世界范围内呈反弹趋势，全世界每年报道的布病病例超过500万，由于布病给动物产品及公共卫生安全带来的经济损失巨大，因此布病的防治十分严峻[6]。
Notomi等[7]在2000年研发了环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LA-MP），在65℃条件下，15-60 min DNA可以扩增1010倍左右，反应结果可通过反应副产物焦磷酸镁白色沉淀的形成进行肉眼观察，或者通过浊度仪检测焦磷酸镁白色沉淀的混浊度来判定[8-11]。该方法与普通PCR相比，具有高特异性、高灵敏度、操作简单、耗时短、结果易于鉴定等特点，具有更大优势。环介导等温扩增技术已被用于对细菌、病毒、寄生虫的检测和动物胚胎性别鉴定等领域[12-19]，在疾病的快速检测方面发展迅速，可对多种疾病进行检测和鉴定，是比较有发展前景的快速诊断手段方法之一。本研究针对布鲁氏菌保守基因16S rDNA设计LAMP引物，对布鲁氏菌进行检测，优化LAMP各反应条件，并对该方法的特异性和灵敏度进行分析比较。
1 材料与方法 1.1 材料羊种布鲁氏菌16M、猪种布鲁氏菌S2、牛种布鲁氏菌2308三种标准布鲁氏菌核酸和小肠耶尔森ATCC9510、大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC10708、金黄色葡萄球菌ATCC33591、志贺氏菌ATCC29903对照菌株均来自于相关实验室馈赠。DNA扩增试剂盒购自广州迪奥生物科技有限公司；蛋白酶k购自宝生物工程（大连）有限公司。
1.2 方法 1.2.1 引物的设计与合成针对布鲁氏菌保守基因16S rDNA设计LAMP引物，引物序列如表 1所示。
提取细菌基因组具体步骤：吸取细菌培养液200 µL，10 000 r/min离心1 min，弃上清。将沉淀用540 µL TE缓冲液重悬。在重悬液中加入30 µL 10%（W/V）SDS、3 µL 2%（W/V）蛋白酶K。混合后37℃温育1 h。用等体积的酚氯仿对裂解细胞抽提两次，12 000 r/min离心2 min，取上清。加入两倍体积的预冷无水乙醇，12 000 r/min离心1 min。沉淀溶解在100 µL的TE缓冲液中，-20℃冰箱保存。
1.2.3 LAMP反应体系的配制根据LAMP反应试剂盒推荐的25 µL体系进行配制，在超净台上进行。
1.2.3.1 染色法反应体系为12.5 µL的反应液RM（2×），内引物（FIP/BIP）各1.5 µL，外引物（F3/B3）各0.25 µL，环引物（LF/LB）各1 µL，Bst聚合酶1 µL，DNA模板1 µL，加超纯水至25 µL。上述试剂混匀后，加20 µL密封液，混匀离心，将1 µL的显色液滴在PCR管盖中央。将上述反应管放入63℃的恒温金属水浴锅内，反应60 min。反应结束后，颠倒PCR管数次，使反应混合液和显色液充分混匀，观察反应液颜色。根据颜色变化观察结果。
1.2.3.2 实时荧光法反应体系12.5 µL的反应液RM（2×），内引物（FIP/BIP）各1.5 µL，外引物（F3/B3）各0.25 µL，环引物（LF/LB）各1 mL，Bst聚合酶1 µL，荧光染料Ⅰ0.5 µL，DNA模板1 µL，加超纯水至25 µL。上述试剂混匀后，加20 µL密封液，混匀离心。使用LC480，选择FAM通道，反应程序为：63℃15 s；63℃15 s、63℃45 s，共45个循环。
1.2.3.3 实时浊度法反应体系12.5 µL的反应液RM（2×），内引物（FIP/BIP）各1.5 µL，外引物（F3/B3）各0.25 µL，环引物（LF/LB）各1 µL，Bst聚合酶1 µL，DNA模板1 µL，加超纯水至25 µL。上述试剂混匀后，加20 µL密封液，混匀离心。将反应管放入LC-320C浊度仪中，63℃ 60 min。根据浊度图判断结果。
1.2.4 LAMP反应条件的优化（1）反应时间：保持DNA扩增试剂盒（迪奥生物科技有限公司）的推荐温度63℃，以5 min为梯度，改变反应时间分别为：65、60、55和50 min、反应结束后根据扩增情况，确定最佳反应时间。（2）反应温度：选择60、61、62和63℃为不同温度条件，以最佳反应时间进行实验，确定布鲁氏菌的最佳反应温度。再以得到的反应温度验证其反应时间也具有以上实验的相似的趋势。（3）引物浓度：布鲁氏菌的引物分为内、外引物和环引物（表 2），两组均进行优化试验。环引物保持不变，内、外引物同时进行梯度变化，同理，环引物进行梯度变化，从而得到最适宜的引物浓度。
分别以羊种布鲁氏菌16M、猪种布鲁氏菌S2和牛种布鲁氏菌2308、小肠耶尔森ATCC9510、大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC10708、金黄色葡萄球菌ATCC33591、志贺氏菌ATCC29903的基因组作为模板，进行特异性实验。
1.2.6 灵敏度试验测定牛种布鲁氏菌2308核酸的浓度为43.6 ng/µL，进行10倍梯度稀释，得到的浓度梯度分别为：43.6 ng/µL、4.36 ng/µL、436 pg/µL、43.6 pg/µL、4.36 pg/µL、436 fg/µL、43.6 fg/µL和4.36 fg/µL。分别取1.0 µL作为反应模板，使用浊度仪法、实时荧光法进行LAMP反应，同时与普通PCR方法进行比较分析。
2 结果 2.1 LAMP实验结果分别以羊种布鲁氏菌16M和牛种布鲁氏菌2308作为1号和2号DNA模板，3号以水作为阴性对照。两种模板使用染色法进行鉴定，发生LAMP扩增反应则PCR管发绿色荧光，没有发生扩增反应则为橙红色（图 1）。采用浊度仪方法，结果（图 2）显示浊度达到0.1以上并且最下方为红色则为阳性，如为绿色则为阴性，即没有核酸扩增。图 3为实时荧光法，出现“S”型扩增曲线则判断阳性，若无“S”型曲线为阴性。以下3个结果图中，1号样品和2号样品均具有阳性判定特征，即有核酸扩增，而3号样品则为阴性结果。与理论分析相符，3种方法均可以检测到布鲁氏菌。
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| 图 1 布鲁氏菌LAMP可视化检测 1 : B.abortus 2308;2 : B.menlitensis 16M;3 :Negative control |
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| 图 2 布鲁氏菌LAMP浊度仪检测 1 : B.abortus 2308;2 : B.menlitensis 16M;3 :Negative control |
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| 图 3 布鲁氏菌LAMP实时荧光检测 B.abortus 2308; B.menlitensis 16M;Negative control |
以布鲁氏菌阳性核酸为模板进行LAMP反应，在浊度仪中设定的4个反应时间的LAMP试验结果如图 4所示。图 4-A与图 4-B样品的浊度值最高并且几乎相同，因此可选择60 min为最佳反应时间。
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| 图 4 时间梯度图 A :65 min; B :60 min; C :55 min; D :50 min |
以布鲁氏菌阳性核酸为模板进行LAMP反应，以6 min为最佳反应时间进行反应温度的优化，反应结果如图 5。实验结果（图 5-C）表明，反应温度在62℃时，LAMP反应扩增效率达到最高，浊度值最大。以62℃进行时间梯度实验（图 6），与2.2.1的结果具有相似的趋势，因此62℃可确定为为LAMP反应最适温度。
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| 图 5 温度梯度图 A :60℃; B :61℃; C :62℃; D :63℃ |
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| 图 6 时间梯度图 A :65 min; B :60 min; C :55 min; D :50 min |
以布鲁氏菌阳性核酸为模板进行LAMP反应，结果如图 7所示，只有3号样品得到了阳性结果，也就是说当体系中内引物为1.5 µmol/µL、外引物0.20 µmol/µL时，才能够检测出布鲁氏菌。而作为不影响阴、阳性结果，仅仅增加反应效率的环引物则与样品浊度表现出线性关系，如图 8所示，会随着环引物的浓度增加样品的浊度也随之增加。因此，环引物的合适浓度则为1 µmol/µL。
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| 图 7 内、外引物浓度优化结果图 1：内、外引物0.50 μmol/μL、0.10 μmol/μL；2：内、外引物1.00 μmol/μL、0.15 μmol/μL；3：内、外引物1.50 μmol/μL、0.20 μmol/μL；4：内、外引物2.00 μmol/μL、0.25 μmol/μL |
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| 图 8 环引物浓度 |
对3株阳性布鲁氏菌和5株对照菌的核酸进行LAMP扩增反应，结果如图 9所示，3株布鲁氏菌反应结果均有扩增，为阳性结果，5株阴性对照菌均为阴性结果。结果表明，本研究建立的LAMP检测方法具有较好的特异性。
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| 图 9 布鲁氏菌LAMP特异性浊度法检测 1 : B.abortus 2308;2 : B.menlitensis 16M;3 :B.suis S2;4 : Yersinia enterocolitica ATCC9510;5 : E.coil ATCC25922;6 : Salmonella ATCC10708;7 : Staphylococcus aureus ACTT33591;8 : Shigella ATCC29903 |
将10倍梯度稀释的牛种布鲁氏菌2308的核酸进行LAMP扩增，图 10为浊度仪中62℃恒温60 min的反应结果，浊度仪的检测低限为4.36 fg/µL，并且最后一个样品的浊度远大于0.1。实时荧光法进行的灵敏度实验结果（图 11）显示，最低检测的样品浓度约为436 fg/µL。普通PCR灵敏度的检测到的最小值为4.36 pg/µL（图 12）。结果表明浊度仪和荧光定量的灵敏度均高于普通PCR。与普通PCR相比，灵敏度大幅提高，具有明显的优势。
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| 图 10 布鲁氏菌LAMP灵敏度浊度法检测 1：43.6 ng/μL；2：4.36 ng/μL；3：436 pg/μL；4：43.6 pg/μL；5：4.36 pg/μL；6：436 fg/μL；7：43.6 fg/μL；8：4.36 fg/μL |
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| 图 11 布鲁氏菌LAMP灵敏度实时荧光检测 1：43.6 ng/μL；2：4.36 ng/μL；3：436 pg/μL；4：43.6 pg/μL；5：4.36 pg/μL；6：436 fg/μL；7：43.6 fg/μL；8：4.36 fg/μL |
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| 图 12 布鲁氏菌LAMP灵敏度电泳检测 M :DL 2000 Marker; 1 :43.6 ng/μL; 2 :4.36 ng/μL; 3 :436 pg/μL; 4 :43.6 pg/μL; 5 :4.36 pg/μL; 6 :436 fg/μL; 7 :43.6 fg/μL; 8 :4.36 fg/μL; 9 : Negative control |
近年来，检测LAMP反应的方法有目视检查浑浊、染色法、实时浊度法和实时荧光法[20-23]。目视检查浑浊是通过LAMP反应产生大量的副产物焦磷酸镁白色沉淀进行判断，但是沉淀量较低时很难直接观察结果。染色法则能显著提高肉眼的识别率，可直接进行阴、阳性结果的判断。实时浊度法和实时荧光法则能够更加直观、精确地判定结果，但是两种方法都需要特定的仪器设备，成本较高。
本研究中对浊度法进行了反应条件优化，在50-60 min的反应时间内，时间对反应的结果影响并不是很大。在进行的特异性实验时，3株布鲁氏菌都显示有核酸扩增，而其他5株阴性对照菌无核酸扩增，判定为阴性，结果表明引物具有较高的特异性。LAMP是一种高灵敏度检测方法，其灵敏度通常比普通PCR约高100倍。通过浊度法、实时荧光和普通PCR 3种方法进行灵敏度分析，分别得到的检测极限为4.36 fg/µL、436 fg/µL和4.36 pg/µL，结果比较后可以得出LAMP检测技术的灵敏度要高于普通PCR，优势明显。图 9中最高浓度的样品在浊度仪实验中反而出现了阴性结果，是否因为样品浓度过高而影响了浊度仪对阴阳性的判断，还需要大量实验进行验证。
4 结论针对布鲁氏菌保守基因16S rDNA设计引物并建立环介导等温扩增技术（LAMP）。通过3种方法对布鲁氏菌进行检测，结果表现出特异性强、速度快且设备要求简单等特点，但对于灵敏度而言，浊度仪法相对具有优势。
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