2. 华南农业大学 广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室，广州 510642
2. Guangdong Provincial Key Lab of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding, South China Agricultural University, Guangzhou 510642
肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一个多功能因子，由脂肪细胞产生并分泌，从多方面影响脂肪细胞的功能。TNF-α在脂肪组织中与多个基因相互联系，起着抑制脂肪生成[1]、促进脂肪细胞脂解[2]等作用。miRNA（microRNA）是近年来逐渐被关注的调控分子，能通过靶mRNA的编码区或3' 非翻译区互补结合实施转录后调控。研究表明miRNA调控哺乳动物至少60%的基因[3]，参与了几乎所有细胞的活动。越来越多的研究结果显示，miRNA对脂肪细胞的分化增殖及脂肪的沉积起至关重要的作用。如miR-130和miR-27家族均通过减少靶基因PPARγ的生物合成抑制人脂肪细胞的分化[4, 5]；而miR-148则是通过靶向CREB基因非翻译区，抑制其表达从而促进人脂肪细胞的分化[6]。
miR-124目前的研究大都与肿瘤相关，研究显示miR-124可抑制髓母细胞瘤细胞[7]、胃癌细胞[8]、乳腺癌细胞[9]、前列腺癌细胞[10]等癌症相关细胞的增殖。miR-124调控脂肪相关功能的研究较为少见，而猪作为沉积脂肪能力最强的动物之一，其与人类在生理生化方面有很多相似性，且存在着天然的脂肪型和瘦肉型品种，因此被认为是研究人类肥胖、糖尿病等脂肪代谢相关疾病最佳的模式动物。
在前期的研究中我们用双萤光素酶系统检测出miR-124与猪TNF-α有直接的靶关系，能显著抑制猪TNF-α的表达[11]。因此，本实验以猪皮下脂肪前体细胞为模型，研究miR-124对猪脂肪细胞分化的影响以及是否通过TNF-α起调节作用。
1 材料与方法 1.1 材料细胞培养板培养瓶购自Corning公司；DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、双抗（青、链霉素）购自GIBCO公司；地塞米松（Dexmethasone）、重组牛胰岛素（Insulin）、油酸（Oleic acid）和辛酸（Octanoic acid）购自SIGMA公司；油红O（Oil Red O）、PMSF购自Amresco公司；转染试剂Lipofectamine 2000、Trizol一步法总RNA提取试剂购自Invitrogen公司；96孔定量PCR板和定量PCR膜购自Axygen；miRNA mimics、inhibitor以及阴性对照（NC）由上海吉玛公司合成；甘油三酯检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；RIPA细胞裂解液和BCA法总蛋白测定试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。
1.2 方法 1.2.1 猪皮下脂肪前体细胞的分离培养采用Zhou等[12]建立的分离培养方法，选取7日龄的长白仔猪，放血处死后用75%（V/V）酒精消毒，在无菌条件下分离背部皮下脂肪，眼科剪将脂肪组织剪碎后用0.1%的Ⅰ型胶原酶于37℃水浴摇床消化1-2 h。消化液过筛后于800×g离心5 min，在沉淀细胞中加入10 mL红细胞裂解液，室温孵育10 min过筛，再用DMEM/F12洗涤细胞，800×g离心10 min后用含10%新生牛血清、100 000 U/L青霉素，100 mg/L的链霉素的DMEM/F12培养液重悬细胞，接种于75 cm2细胞培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。
1.2.2 细胞的转染及诱导生长良好的脂肪前体细胞消化后以1.5×105 cells/cm2接种到6孔板中，细胞24 h内汇合90%时，将70 ng miR-124 mimics或inhibitor与LipofectamineTM 2000进行孵育，按照说明书操作方法转染细胞，并以NC作为阴性对照，每个处理设6个重复。转染24 h后用含胰岛素、地塞米松、油酸和辛酸（各50 nmol/L）的分化培养基进行对细胞诱导，连续诱导8 d。
1.2.3 油红O染色将诱导8 d的脂肪细胞用DMEM/F12洗两次，加入200-250 μL 4%多聚甲醛固定液固定后加入油红O工作液染色30 min；染完用清水冲洗去掉残留的油红O，滴加适量甘油封孔，置于倒置显微镜下观察拍照。
1.2.4 甘油及甘油三酯检测细胞诱导过程中收集细胞培养基进行甘油检测；诱导8 d后脂肪细胞用DMEM/F12洗两次，加入100 µL细胞裂解液（含1 mmol/L PMSF的RIPA细胞裂解液），轻轻摇动培养板充分裂解细胞，将细胞裂解液转移到500 µL离心管中，BCA（bicinchoninic acid）法测定每孔细胞总蛋白含量；甘油和甘油三酯测定分别根据试剂盒说明书进行检测，检测结果根据标准曲线计算待测样品中甘油和甘油三酯的浓度，所得数据均用总蛋白数据进行校正。
1.2.5 Western blot检测提取分化成熟脂肪细胞的总蛋白，用5%PAGE浓缩胶和10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶对总蛋白进行电泳分离，分离完全后将胶上TNF-α蛋白和β-actin分别转到PVDF膜上，1×TBS洗涤膜10 min后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。封闭后的PVDF膜加入2 mL适度稀释的蛋白一抗，4℃冰箱旋转孵育过夜。次日移出剩余的一抗，加入2 mL 1:5 000稀释的红外二抗孵育1 h，蛋白显像用Odyssey红外成像仪（LI COR）扫描。
1.2.6 定量检测Trizol一步法抽取诱导后皮下脂肪细胞总RNA，OligodT18反转录成cDNA，并以此为模板进行各相关基因的荧光定量PCR检测，所用引物如下：
PPARγ：S-CATTCGCATCTTTCAGGG，A-TGGACGCCATACTTTAGGA；
FASN：S-ACCGAGTGGCTGGGTATT，A-CAAGAAGAGGTTGTTGTGGG；
HSL：S-GCCCGAGACGAGATTAG，ATGAAGGGATTCTTGACG。
检测结果以β-actin作为内参照，根据以下公式计算出目的基因相对于内参基因的比值来反应各基因mRNA表达丰度：2-ΔCt＝2-（Ct目的基因-Ct内参基因）。
1.2.7 数据统计组间差异采用t检验进行分析，以P < 0.05作为差异显著性检验标准。所有数据分析均由SPSS19.0统计软件完成。
2 结果 2.1 猪皮下脂肪前体细胞的诱导分化猪皮下脂肪前体细胞铺满培养板底90%时将培养基更换为含有含胰岛素、地塞米松、油酸和辛酸（各50 nmol/L）的分化培养基，隔天换液，连续诱导8 d。从显微镜下可以观察到（图 1），诱导2 d后细胞开始出现黄色小脂滴，此后随着诱导天数的增加，脂滴的数量逐渐增多，体积逐渐增大。第8天时可以清楚地观察到细胞的形态以及脂滴在细胞中的分布，前期出现的脂滴在此时已变得饱满明亮，周围挤满了后期分化的脂滴。
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| 图 1 猪脂肪细胞分化模型 |
前期研究工作中得出miR-124能通过种子序列抑制TNF-α的表达，为了进一步研究miR-124是否作用于猪脂肪细胞中TNF-α的表达，利用前体细胞的分化模型，以1.5×105 cells/cm2的密度将前体细胞接种于6孔板中，待细胞铺满90%时，分别转染miR-124 mimics以及阴性对照NC，转染24 h后将培养基更换为分化培养基进行分化诱导，连续诱导8 d后收集细胞蛋白，Western blot检测结果（图 2）显示，过表达miR-124会抑制猪脂肪细胞中TNF-α的表达。
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| 图 2 miR-124抑制TNF-α蛋白表达 |
为了研究miR-124对猪皮下脂肪前体细胞的调节作用，待细胞铺满90%时，分别转染miR-124 mimics、miR-124 inhibitors和NC，转染24 h后进行分化诱导，连续诱导8 d，收集细胞检测各处理细胞的总蛋白量及TG含量。校正结果（图 3-A）显示，转染miR-124 mimics的细胞TG含量比对照组显著增加（P < 0.01），转染miR-124 inhibitor的细胞对照组TG含量比对照组显著降低（P < 0.01）。油红O对脂肪细胞染色结果与TG检测结果一致。从图 3-B和3-C可以看出，过表达miR-124时细胞脂滴增多，抑制则呈现相反的结果。同时，又对细胞的甘油含量进行了检测（图 3-C），发现表过达miR-124的细胞甘油含量也显著增加（P < 0.05）。
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| 图 3 miR-124调控脂肪细胞的聚酯分化 A：诱导分化聚酯后细胞TG含量的变化；B：细胞聚酯情况；C：油红O含量；D：甘油含量变化。**代表与对照差异极显著（P < 0.01），*代表与对照差异显著（P < 0.05） |
为了验证miR-124是否通过TNF-α影响脂肪细胞的分化，收集诱导8 d的脂肪细胞进行RNA抽取并反转录为cDNA，荧光定量检测与TNF-α相互调节且对脂肪细胞分化起重要作用的转录因子和酶的表达，结果（图 4）显示，转染miR-124 mimics的细胞PPARγ、FASN和HSL的表达均显著上调（P < 0.01），而抑制miR-124表达的细胞PPARγ和FASN的表达显著下调（P < 0.05），而HSL则同样显著下调（P < 0.05）。
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| 图 4 miR-124调控脂肪细胞代谢相关基因的表达 |
本研究以猪皮下脂肪前体细胞为模型进行诱导分化，分化过程中可见细胞内的脂滴随着分化天数的增加不断变多、变大，且能被油红O所染色，说明猪皮下脂肪细胞培养成功，保证后续实验的开展。在前期实验中发现miR-124能抑制猪TNF-α的表达，而TNF-α在脂肪细胞中能够通过NIK-TAK1/TAB 1轴激活NFκB对PPARγ进行抑制[13]，从而起到一定的脂解作用。本研究中细胞过表达miR-124后表现为TNF-α蛋白含量减少，脂滴增多，甘油三酯含量显著增加，可能为细胞分化过程中miR-124通过抑制TNF-α的表达减缓对PPARγ的抑制，使细胞表现为促进脂肪合成。定量检测中显示PPARγ和FASN的表达显著上升，其中PPARγ是脂肪前体细胞分化中后期两个最重要的转录调控因子之一，而FASN在脂肪酸合成中起着至关重要的作用，影响着动物脂肪的沉积。定量的结果正好印证了上述推测观点。
过多的的脂肪将通过脂肪动员，在HSL的刺激下分解成甘油和游离的脂肪酸，但是，细胞上清甘油的含量和细胞HSL的表达并不如预测中般下降，而是上升。有研究也显示，TNF-α能够抑制HSL mRNA表达[14]，因此，本研究中过表达miR-124提高HSL基因表达可能是通过抑制TNF-α的表达来完成的，且对应地表现为细胞甘油含量显著增加。猪脂肪细胞的合成与分解途径是相互协调的[15]，因此推测实验中过表达miR-124使脂肪细胞合成代谢加快，TG含量显著增加，但细胞为了维持代谢平衡，提高内部分解代谢酶的表达，一定程度上促进了脂肪的分解，因此甘油含量比对照组高。即过表达miR-124同时促进了脂肪的合成代谢与分解代谢，合成代谢速度比分解代谢快使细胞表现为脂滴增多。
另外，实验还研究了抑制miR-124的表达细胞TNF-α蛋白水平和脂滴的变化，TG和甘油含量变化以及相关基因的表达变化，结果显示，细胞的聚酯情况，TG含量，PPARγ和FASN的表达均表现为与miR-124 mimics相反的作用，但TNF-α的蛋白水平及甘油含量均没显著变化，而HSL表达虽然不及mimics般显著但同样表现为上升，这可能为多个小RNA同时作用于相同靶基因，抑制之后其他小RNA会有一定的补偿效应。
4 结论miR-124能通过调节TNF-α的表达调控脂肪细胞的分化，过表达miR-124将促进细胞的聚酯，提高TG的含量，提高相关基因的表达，而抑制miR-124的表达则结果相反。
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