猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）属于细小病毒科细小病毒属，是一种自主复制型病毒，是造成母猪繁殖障碍性疫病的主要病原体之一；母猪感染该病毒后可导致流产、木乃伊胎及死胎等，其给国内外养猪业造成了严重的经济损失；Mary与Mahnel在1966年首次发现了该病毒，而后发展到世界多个国家和地区；在20世纪80年代，我国的多个地方都分离发现猪细小病毒病^[1]。目前，随着分子生物学诊断技术的发展，PPV2、PPV3、PPV4、PPV5和PPV6等几个新型猪细小病毒已被发现，这几个新型的PPV在基因组方面，尤其是在VP2基因方面存在较大差异性；虽然研究者在一定程度上对其临床发病率和潜在作用进行了相关研究，但是其致病性尚不清楚^[2-4]。PPV1是猪细小病毒家族中重要的成员，也是猪群中最常见的猪细小病毒型^[5]。与此同时，PPV1常与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV）等繁殖性障碍病毒混合感染而导致猪只发病，给养猪业造成严重的经济损失^[6]。因而，加强猪细小病毒的研究，对有效预防和控制PPV而言都有着重要意义。

PPV病毒为单股线状DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称结构，基因组全长约为5 kb，含有2个主要的开放阅读框（ORF），其中ORF1编码3个非结构蛋白NS1、NS2、NS3；ORF2编码2个结构蛋白VP1、VP2，VP2可进一步水解为VP3^[7]。组成核衣壳的主要结构蛋白是VP2，其分子大小为64 kD，由579个氨基酸构成，VP2具有良好的抗原性，在病毒的致病性方面起着重要重要，并且可以诱导动物机体产生保护性免疫反应^[8]。有研究者发现，在VP2的第60-68位、第81-88位、第266-275位、第351-357位、第398-404位氨基酸是主要的抗原位点区域^[9]。因此，本研究主要以NADL-2经典毒株的VP2基因为参考序列，以猪细小病毒AV31毒株的DNA为模板，设计了编码VP2蛋白第155-439位氨基酸的表达引物，诱导表达该氨基酸片段，并对表达产物进行鉴定，探讨该重组蛋白的反应原性，为后续的诊断方法或试剂盒的开发奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

pET30a（+）载体购于Novagen公司，DNA Marker、蛋白Marker、BamH Ⅰ、Xho Ⅰ限制性酶都购于TaKaRa公司，质粒小量制备试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR清洁试剂盒都购于AxyPrep公司，Taq DNA聚合酶购自Fermentas公司，异丙基-β-D-硫代半乳糖甘（IPTG）、辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗猪IgG购于SIGMA公司，即用型透析袋购于Spectrum公司，蛋白胨、酵母提取物购自OXOID（英国）公司，Ni-NTA树脂购于QIAGEN公司，AV31毒株购于中国兽药监察所，卡那霉素购于Hyclone公司，PPV1阳性血清为采用猪细小病毒灭活疫苗（WH-1株）（购于中牧实业股份有限公司）制备的高免阳性血清、NA-PRRSV阳性血清、PCV2阳性血清购于VMRD公司，NA-PRRSV-重组N蛋白、PCV2-重组Cap蛋白由本实验室自己制备，并且都有较好的抗原性；感受态大肠杆菌Trans109和BL21（DE3）均为本实验室保存，其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法 1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank公布的NADL-2经典毒株的VP2基因为参考序列，设计VP2蛋白的第155-439位氨基酸编码区的表达特异性引物，在上游引物上加上BamH Ⅰ限制性酶切位点，在下游引物上Xho Ⅰ限制性酶切位点。上游引物P1：5'-CAGGATCCGCAACCTCACCACC-3'；下游引物P2：5'-GCCTCGAGATGCATGTTAGATTTCCC-3'，引物由Invitrogen（上海）公司合成。

1.2.2 病毒DNA提取与PCR扩增

按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒的操作说明提取PPV 1型AV31细胞毒株的DNA，以抽提的DNA为模板，采用50 μL反应体系，即Ex-Taq酶25 μL，上下游引物各1 μL，模板2.5 μL，补水至50 μL。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，进行35个循环；72℃延伸10 min。取10 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，样品于-20℃保存。

1.2.3 pET30a-PPV-VP2重组载体的构建与鉴定

利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ分别对pET30a（+）载体和DNA凝胶回收产物进行酶切反应，反应体系为：PCR胶回收产物或pET30a（+）载体20 μL，10×K Buffer 3 μL，BamH Ⅰ 2 μL，Xho Ⅰ 2 μL，ddH₂O 3 μL，总体体积为30 μL。轻微振荡混匀，瞬时离心，先放入30℃水浴3 h，再37℃水浴3 h。酶切产物经T4连接酶16℃连接过夜，取连接产物转化于Trans109大肠杆菌感受态细胞，涂布于含卡那霉素抗性的LA平板上，37℃培养12 h，挑取单菌落过夜培养，离心收菌，质粒提取试剂盒提取质粒，对质粒进行BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切鉴定。将构建成功的pET30a-PPV1-VP2重组质粒转入BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞，并按上述相同方法培养，提取质粒，对质粒分别进行PCR鉴定和BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切鉴定。反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，同时将阳性重组质粒送往GENEWIZ（金唯智）公司进行测序。

1.2.4 重组蛋白表达及SDS-PAGE电泳鉴定

分别设置终浓度为0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L的IPTG，诱导温度为25℃、30℃、37℃，诱导时间为6 h、12 h、24 h，优化诱导表达条件；将筛选出的阳性重组质粒的表达菌（即BL21（DE3）大肠杆菌感受态）于37℃振荡培养约3 h，至OD₆₀₀为0.6-1.0时，加入终浓度为1 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h，12 000 r/min离心收菌，ddH₂O悬浮洗涤，对菌体进行SDS-PAGE电泳分析，观察重组蛋白表达情况，再对重组菌体悬浮液进行超声破碎，离心收集上清裂解液和沉淀，分别进行SDS-PAGE电泳分析，分析重组蛋白的存在方式。

1.2.5 重组蛋白Ni-NTA树脂纯化及复性

对以包涵体形式表达的重组蛋白分别用包涵体洗涤缓冲液（pH8.0）、2 mol/L尿素洗涤2-3次，离心弃上清液保留沉淀，再用Buffer B（pH8.0）溶解包涵体沉淀，离心弃沉淀保留上清液。将样品与Ni-NTA树脂室温结合40 min，上柱，然后分别用Buffer C（pH6.3）、Buffer D（pH5.9）、Buffer E（pH4.5）洗涤柱子，并分别收集对应积份，对每个积份进行SDS-PAGE分析，确定目的蛋白存在于何种积份，并测定含有目的蛋白条带积份的OD₂₈₀值。再将纯化后的蛋白液依次放于8 mol/L尿素、4 mol/L尿素、2 mol/L尿素、1 mol/L尿素、PBS液中进行透析复性，每种透析液透析时间为6 h，最后对复性蛋白进行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重组蛋白的Western blot分析

纯化的未复性VP2蛋白和复性VP2重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加PPV1阳性血清（1:100稀释）于室温摇床孵育1 h，PBST缓冲液洗涤PVDF膜3遍，再加HRP标记的猪二抗（1:5 000稀释）于室温摇床孵育1 h，PBST缓冲液洗PVDF膜3遍，HRP-DAB底物显色试剂避光显色10 min，暗室中曝光，同时设pET30a空载体诱导表达菌作为阴性对照；采用上述相同的方法将复性VP2重组蛋白与NA-PRRSV-重组N蛋白，复性VP2重组蛋白与PCV2-重组Cap蛋白分别转印至2张PVDF膜，脱脂奶粉封闭，分别加美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（NA-PRRSV）阳性血清（1:100稀释）、猪圆环病毒2型（PCV2）阳性血清（1:100稀释）作为一抗，再加HRP标记的兔抗猪二抗（1:5000稀释），显色曝光。

2 结果 2.1 PCR扩增结果

以PPV 1型AV31细胞毒株的DNA为模板，P1、P2为引物，扩增获得1条约849 bp的目的片段（图 1），与预期结果相符合。

2.2 重组质粒的鉴定结果

构建的重组质粒pET30a-PPV1-VP2经PCR鉴定，获得849 bp的部分VP2基因目的片段，而阴性对照无目的条带（图 2）；重组质粒经BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切鉴定，获得849 bp的VP2基因片段和5 422 bp的pET30a（+）载体片段，而阴性对照无目的条带（图 3）。

2.3 重组蛋白表达、Ni柱纯化及复性结果

BL21（DE3）表达菌在不同诱导剂浓度、诱导时间下进行诱导表达，实验结果表明，不同诱导剂浓度和诱导时间对目的蛋白的表达量无显著影响，但诱导剂浓度越高，诱导时间越长，则杂蛋白条带越多；在IPTG终浓度为1 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间6 h的条件下对重组表达菌进行诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，发现表达产物的分子量约为39 kD（图 4），与理论值相一致，同时发现目的蛋白主要以包涵体形式存在。Ni-NTA树脂纯化的目的蛋白主要集中于E2-E7积份，其中在E3-E6阶段出现较集中的洗脱峰（表 1、图 5）。并且复性后的重组蛋白较纯于未复性的重组蛋白，几乎无其他杂蛋白带（图 4）。

2.4 重组蛋白的Western blot分析结果

表达蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转印至PVDF膜，用PPV1阳性血清检测重组蛋白的反应原性。结果（图 6-B）表明，在39 kD处出现特异性的显色条带，而pET30a空载体处无特异性条带。因此，PPV1-VP2重组蛋白与PPV阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性。同时，复性后的纯化重组蛋白不与PCV2、NA-PRRSV阳性血清发生交叉反应（图 6-A），这表明该重组蛋白具有很好的特异性。

3 讨论

猪细小病毒作为引起母猪繁殖障碍性疫病的主要病原体之一，导致感染母猪出现流产等症状，给国内外养猪业造成了严重的经济损失；PPV主要分为NADL-2株、NADL-8株、Kresse株、肠炎型毒株4种类型，但这4类毒株共用一种血清型^[10]，目前在中国大陆较为高发的毒株是JSNJ62^[11]。近年来，有学者采用PK-15等细胞系对PPV的增殖及感染机制进行研究，取得丰硕的成果^[12-14]，Ren等^[15]对PPV的系统发育与演变进行了研究，发现在大约250年前，PPV拥有共同祖先。VP2是组成猪细小病毒衣壳的主要结构蛋白，其具有良好的免疫原性，VP2基因被VP1基因完全包含于内，研究者发现暴露在外的378、383、436等几个氨基酸残基决定着PPV的趋向性和毒力，该位点主要通过与宿主的多细胞因子反应发挥其作用，而不是与宿主细胞表面的受体^[16]。Sun等^[17]通过研究杆状病毒表达的重组PPV1-VP2蛋白来鉴定3种VP2蛋白特异性B细胞的线性表位，明确了VP2抗原的结构，以及为PPV1-VP2血清学诊断和抗原检测奠定基础。大肠杆菌表达载体作为成熟的表达载体，其拥有生长速度快、便于培养等特点，并且其中的pET30a载体可用于目的基因的大量诱导表达^[18]。

本实验通过扩增猪细小病毒1型VP2序列的第469-1317位基因（长度为849 bp），构建pET30a-PPV1-VP2重组表达载体，BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切鉴定呈阳性。重组大肠杆菌表达系统在IPTG的诱导下，诱导表达出大小约为39 kD的重组VP2蛋白，研究发现目的蛋白以包涵体形式存在。通过Ni-NTA树脂对包涵体蛋白进行纯化，得到较高纯度的目的重组蛋白，并对纯化后蛋白进行复性处理；研究发现，复性后的重组蛋白纯度高于复性前，由于蛋白复性是一个复杂的过程，这可能是重组蛋白在恢复高级结构的过程中，在蛋白疏水键的形成以及透析膜的滤过等作用下，对重组蛋白完成了一定程度的纯化作用^[19]。重组VP2蛋白与PPV1阳性血清进行Western blot反应呈阳性，与NA-PRRSV、PCV2阳性血清Western blot反应呈阴性，表明该重组蛋白具有很好的反应原性，并且不与NA-PRRSV、PCV2阳性血清发生交叉反应。

4 结论

本实实验成功构建了pET30a-PPV1-VP2（155-439 aa）原核表达载体，实现了VP2基因在大肠杆菌中的表达，纯化后的复性重组VP2蛋白具有较好的反应原性。