血管内皮黏附分子（Cadherin 5，CDH5）是血管内皮细胞中的特异性的黏附分子，为黏附分子家族中的成员。其作用主要表现在能够介导细胞之间的黏附、调控细胞信号转导（如MAPK信号通路）、调节细胞周期和凋亡来调控细胞增殖、存活和分化等^[1-3]。目前，CDH5已在斑马鱼（Danio rerio）、人血管内皮、小鼠、猪中被发现^{[3, 4]}。关于CDH5基因的报道主要集中在克隆、鉴定、启动子调控和免疫调控等方面^[5-12]。齐口裂腹鱼（Schizothorax prenanti），又称雅鱼，属鲤科（Cyprinidae）、裂腹鱼亚科、裂腹鱼属，主要分布在我国长江上游的岷江、金沙江、青衣江、大渡河等水域，是我国特有的冷水性经济鱼类^{[13, 14]}，具有极高的营养价值和经济价值。近年来，随着养殖户养殖面积的扩大，细菌性疾病逐年发生，而温和气单胞菌（Aeromomas sobria）是一种常见的人鱼共患的致病菌，养殖实践表明该菌已经对渔业生产造成了较大的经济损失。因此，需要从基础研究的角度发掘鱼的免疫相关基因，探讨其抗细菌免疫机制，从而为渔业生产的疾病控制服务。目前，有关齐口裂腹鱼免疫相关基因的研究主要有过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）^[15]、MyD88^[16]、心型脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid binding protein，H-FABP）^[17]、同种移植炎症因子（allograft inflammatory factor-1，AIF-1）^[18]等，尚未见CDH5基因的报道。因此，本实验从课题组已经构建的齐口裂腹鱼脾脏的转录组中获得CDH5基因的全长cDNA序列，采用Real-time PCR分析齐口裂腹鱼感染温和气单胞菌后CDH5基因的表达量变化，旨在为研究CDH5基因在鱼类中的作用积累科学资料。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

健康的齐口裂腹鱼来源于四川雅安某养殖场，共20尾，体长35-40 cm，体重390-410 g。

1.1.2 实验试剂

温和气单胞菌株（WS6202）由本实验室留存，Trizol试剂购于Invitrogen公司，异丙醇、DEPC溶液、氯仿、RocketScript^TMRT PreMix购于BIONEER公司，IQ^TMSYBR Green Supermix购于BIO-RAD公司。

1.2 方法 1.2.1 齐口裂腹鱼感染实验

将实验室保存的温和气单胞菌株常温复苏，参照麦氏比浊法制成浓度为2.0×10⁸ CFU/mL的菌悬液，取1 mL菌液注射鱼腹腔内，保持28℃水温，用充氧泵间歇供氧。分别在0 h、24 h和48 h随机采3尾，记为0 h组、24 h组和48 h组并收集不同组鱼脾脏、心脏、肾脏、肝脏、肌肉、肠道6种组织于液氮快速冷冻后，-80℃保存。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成

将各组鱼的脾脏、心脏、肝脏、肾脏、肌肉、肠道组织从-80℃冰箱中取出，用Trizol提RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测RNA提取质量和完整性。按照TaKaRa公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒说明书进行cDNA的合成。合成的各组组织cDNA放于-20℃冰箱保存。

1.2.3 CDH5基因的生物信息学分析

用DNAStar软件分析该序列，用NCBI数据库中的Blastp进行序列比对，用ORF Finder对开放性阅读框进行分析，齐口裂腹鱼CDH5基因氨基酸序列分析应用DNAMAN软件，用ExPASy程序中的Interproscan、SOPMA、TMpred、SignalP、Smart、NetPhos 2.0、NetNGlyc 1.0分别对蛋白质的理化性质、二级结构、跨膜螺旋特征、信号肽、结构域、磷酸化位点和糖基化位点进行预测分析。系统进化树的构建应用Clustalx1.83和Mega5.0软件。

1.2.4 引物设计

参照转录组中CDH5基因序列，用Primer Premier 5.0设计定量引物，CDH5引物序列Primer A：5'-CCGAGAGAAACAGAGTCAGTAT-3'，Primer B：5'-AGTCACAATCGTAGTAGCAGAAT-3 '，齐口裂腹鱼18S rRNA内参基因引物序列Primer F：5'-GGAATGAGCGTATCCTAAACCC-3'，Primer R：5'-CTCCCGAGATCCAACTACAAGC-3'，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.5 CDH5基因定量分析

分别以不同组6种组织的cDNA为模板，每个样品3个平行。以齐口裂腹鱼18S rRNA基因作内参，进行CDH5定量检测。10 μL反应体系：ddH2O 1.2 μL，Primer F 0.4 μL，Primer R 0.4 μL，SYBR Green^® Supermix 6 μL，模板2 μL。反应程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s，59℃ 20 s，72℃ 30 s，39个循环；65℃ 5 s；95℃ 10 s。对溶解曲线分析后，所得实验数据用-2^ΔΔCt法计算，并利用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析（One-way ANOVA）对CDH5基因进行显著性分析。

2 结果 2.1 CDH5基因序列分析

从转录组获得CDH5基因的全长cDNA序列（GenBank登录号为：KT329441），该序列长4 825 bp，5'-UTR长346 bp，3'-UTR长2 165 bp，有典型的加尾信号AATAAA及PloyA尾。开放阅读框长2 313 bp，编码770个氨基酸（图 1）。在线软件预测显示，该蛋白相对分子量为85.19 kD，等电点5.01。带负电荷残基数（Asp+Glu）为111，带正电荷残基数（Arg+Lys）为83。脂肪系数为81.38。不稳定系数为38.71，为稳定蛋白。CDH5蛋白出现频率较高的氨基酸有Ser（9.1%）、Asp（8.6%）、Leu（7.4%）、Ile（7.1%）。总平均亲水性为-0.421。TMpred跨膜螺旋分析CDH5蛋白跨膜特征，参照跨膜拓扑学分析模型，要求当分值大于500时该蛋白有跨膜螺旋推测，CDH5蛋白有2个明显的跨膜螺旋区。

SigalP信号肽分析表明，该蛋白存在一个由29个氨基酸组成的信号肽序列。该序列位于第1-29位，切割位点在29-30位氨基酸之间，表明该蛋白为分泌型蛋白。CDH5蛋白二级结构预测（图 2）显示，该蛋白随机卷曲占41.17%、延伸链占26.75%，α-螺旋占22.73%，β-转角占9.35%。Smart预测CDH5蛋白结构域显示，该蛋白包括5个重复钙黏蛋白结构域（CA domain，黄色部分）、2个跨膜域（Transmembrane region，蓝色部分）和4个低组分复杂性区域（Low complexity，紫色部分）（图 3）。NetPhos 2.0蛋白磷酸化位点预测显示，CDH5蛋白氨基酸序列有57个磷酸化位点，分别位于丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）和苏氨酸（Thr）残基上，即有42个丝氨酸磷酸化位点，6个酪氨酸磷酸化位点和9个苏氨酸磷酸化位点。NetNGlyc 1.0糖基化位点预测显示，该蛋白有6个N-糖基化位点，分别为（¹²¹NLTA¹²⁴）、（¹³⁸NDTF¹⁴¹）、（¹⁹⁷NGTD²⁰⁰）、（⁴⁸⁰NRSH⁴⁸³）、（⁵²¹NFTL⁵²⁴）和（⁵²⁹NNTA⁵³²）。

2.2 CDH5同源性及系统进化树分析

用NCBI中的Blastp程序进行比对分析显示，齐口裂腹鱼CDH5氨基酸序列与其它物种的相似性大约为41%-74%，其中与斑马鱼（D. rerio）相似性最高，达74%，与白斑狗鱼（Esox lucius）相似性为53%，与人（Homo sapiens）的相似性为43%。用DNAMAN软件对不同物种CDH5氨基酸序列进行同源性比对（图 4）显示，齐口裂腹鱼CDH5氨基酸序列在不同物种中比较保守。用Mage 5.0软件，选取相似性较高的序列构建系统进化树（图 5）。在系统进化树上，齐口裂腹鱼CDH5氨基酸序列与斑马鱼CDH5亲缘关系最密切，其最先与斑马鱼聚为一类，随后与白斑狗鱼聚为一类，最后再与其他哺乳类动物聚为一类。

2.3 齐口裂腹鱼CDH5对温和气单胞菌感染的应答

以18S rRNA基因作为内参进行Real-time PCR反应，结果（图 6）显示，CDH5基因在健康齐口裂腹鱼各组织中均有不同程度的表达。在0 h各组织的表达量大小顺序为肝脏  >  脾脏  >  肌肉  >  心脏  >  肾脏  >  肠道。在温和气单胞菌感染后，脾脏中CDH5基因在24 h表达量显著高于0 h和48 h（P < 0.05）。肝脏、肾脏和肌肉中CDH5在48 h的表达量均显著高于24 h（P < 0.05）。心脏和肠道中CDH5基因在48 h的表达量显著高于0 h（P < 0.05）。

3 讨论

钙黏素（Cadherin，CDH）是一种重要的黏附分子，最初被定义为依赖Ca²⁺的细胞黏附分子，其作为钙黏素家族成员之一，主要作用为介导上皮细胞之间的粘附，参与细胞分化等过程^[19]。Dejana等^[6]体外研究显示，CDH5在内皮细胞生物学功能研究方面具有重要作用，主要表现在调节细胞黏附，细胞增殖、存活，细胞形状，细胞运动性，调节信号传导途径及调控转录基因等方面。Schubert等^[20]研究显示，CDH5基因是由糖皮质激素所调节，且与中心性浆液性脉络膜视网膜病变有关，可以增加脉络膜血管的渗透性。Vestweber等^[21]研究表明CDH可通过多种途径调节细胞增殖及凋亡，对胚胎发育过程也起重要作用。

迄今为止，CDH5基因在鱼类中仅见在斑马鱼和白斑狗鱼中的报道。吴西军等^[4]从斑马鱼胚胎中克隆出CDH5全长序列为3 061 bp，编码区长2 301 bp，本实验获得齐口裂腹鱼CDH5基因全长为4 825 bp，编码区长2 313 bp，造成此差异的原因可能是由于不同品种的CDH5基因的片段大小存在一定的差异，或是不同的环境压力下变异程度可能出现差异有关。生物信息学分析显示，CDH5蛋白不稳定系数为38.71，而稳定蛋白标准为不稳定系数小于40，由此可知，CDH5蛋白为稳定蛋白^[23]。CDH5蛋白存在1个信号肽序列和2个明显的跨膜螺旋区，表明此蛋白可能在细胞质中合成，分泌过程后将信号肽切除，从而形成具生物学功能的蛋白，为分泌型蛋白^[24]。Smart预测CDH5蛋白结构域显示，CDH5包括一个保守的由5个串联重复的胞外钙黏蛋白结构域、2个跨膜域和4个低组分复杂性区域。这和王宾等^[22]报道的在胞外域，经典钙黏蛋白有5个同源染色体重复序列片段相一致，但有1个跨膜域有所不同，原因可能是由于物种不同所造成。系统进化树分析显示，齐口裂腹鱼与斑马鱼聚为一簇，表明彼此亲缘关系较为密切。基因在不同组织中不同时间点的表达特征可能是其功能的一种表现，实时荧光定量PCR显示，CDH5基因在健康齐口裂腹鱼各组织中均有表达，也提示CDH5可能具有多种生物学功能。虽然CDH5基因广泛分布，但其表达量存在一定差异。在温和气单胞菌感染后，CDH5基因在脾脏中24 h表达量最高，这表明该基因在此时间参与了对温和气单胞菌的应答，而在48 h表达量降低，但与0 h相比，也有一定程度的增加。这说明CDH5基因在48 h也可能参与了机体抵抗细菌侵染的免疫反应。

4 结论

本实验获得齐口裂腹鱼CDH5基因的cDNA全长序列，通过生物信息学分析，结合其在健康齐口裂腹鱼各组织的表达情况以及温和气单胞菌刺激下的表达变化，初步揭示其在齐口裂腹鱼的免疫防御反应中发挥的一定作用。