恶性肿瘤是当今人类生活中最危险的疾病之一，其致死率在发达国家中位居第一，在发展中国家也位居第二^[1]。随着世界人口数量的不断增加，人口老龄化的不断加剧及工业化引起的人类生活环境质量的不断下降，许多恶性肿瘤的患病率仍将继续上升。由于恶性肿瘤大都具有高发病率和高致死率的特点，越早发现，其治愈的几率就越大，因此恶性肿瘤的早期诊断已成为肿瘤治疗及延长患者生命的关键^[2]。作为一种强有力的系统生物学工具，蛋白质组学（proteomics）技术的快速发展在深度和广度上不断推进恶性肿瘤的研究进程。利用蛋白质组学技术对恶性肿瘤分泌蛋白质组进行系统研究，找到特异性强、灵敏度高的肿瘤标志物，进而揭示其表达水平的变化与恶性肿瘤发生发展不同阶段的相互关系与规律，已逐渐成为恶性肿瘤早期诊断的最有效途径，本文对分泌蛋白质组学技术在肿瘤标志物研究中的进展进行了分析，以期为新的肿瘤标志物的发现及筛选提供借鉴。

1 分泌蛋白、分泌蛋白质组及分泌蛋白质组学

分泌蛋白（secreted proteins/secretory proteins）是对所有在细胞内合成，再被分泌到其它细胞器、细胞外环境及其它细胞内起作用的蛋白质的统称，主要包括细胞因子、生长因子、补体、降解酶类、抗体、肽类激素及免疫球蛋白等具有重要生理功能的蛋白质。根据蛋白质分泌过程中是否有N端信号肽的参与，分泌蛋白可简单分为经典分泌蛋白和非经典分泌蛋白两大类^{[3, 4]}。1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams^[5]首次提出了蛋白质组（proteome）的概念，以表征一个基因组、细胞或组织在一定时期内所表达出的所有蛋白质。2000年，Tjalsma等^[6]在研究枯草杆菌分泌蛋白时，在蛋白质组的基础上又提出了“分泌蛋白质组”（secretome）的概念。分泌蛋白质组是指一个基因组、细胞或组织所表达的全部分泌蛋白，其数量约为整个蛋白质组的30%^[7]。分泌蛋白质组学（secretomics）则是以分泌蛋白质组为研究对象，利用蛋白质组学技术从整体水平上对分泌蛋白组成及其活动规律进行的研究^[8]。

2 肿瘤标志物与分泌蛋白质组学

肿瘤是由遗传和环境等多种因素协同作用所致的疾病，其细胞具有无限增殖的特点。肿瘤标志物（tumor markers，TMs）是指在恶性肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞合成分泌的或因机体对肿瘤反应而异常产生或升高的，反映肿瘤存在与生长的一类物质^[9]。肿瘤标志物包括DNA、RNA、蛋白质和代谢物等活性分子^[10]。通过对血液、尿液、脊髓液等体液和细胞中该类物质的定性定量检测，可为判断是否存在肿瘤、肿瘤的类型、肿瘤发展阶段、疗效及预后评估等提供实验依据^[11]。理想的肿瘤标志物应具有灵敏度高、特异性强、易于检测、经济性好、可定位肿瘤等特点。

在恶性肿瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞会分泌出诸如细胞因子、蛋白水解酶等多种蛋白质，而不同类型、不同发展阶段的肿瘤细胞释放出的分泌蛋白的种类与表达水平也各不相同，分泌蛋白已成为潜在肿瘤标志物的主要来源^[12-18]。因此，利用分泌蛋白质组学技术对恶性肿瘤细胞分泌物进行系统深入的研究，不仅有助于全面理解、认识、分析与解释恶性肿瘤发生和发展的分子机制，对于肿瘤标志物的筛选，肿瘤的早期诊断、监测、治疗及抗肿瘤药物的研发等也具有重要指导意义。近期的研究还证实，非经典分泌也是恶性肿瘤细胞转运蛋白质的主要途径之一，而一些非经典分泌蛋白则成为被忽略的潜在肿瘤标志物和药物靶点^{[19, 20]}。

3 肿瘤分泌蛋白质组的研究策略

肿瘤分泌蛋白质组的研究策略可分为两大类，即基于基因组学技术和基于蛋白质组学技术的研究^{[21, 22]}。基于基因组学技术的研究策略：首先利用基因芯片对实验样品进行检测，以获取肿瘤相关的基因序列特征信息；再采用生物信息学方法进行分析，筛选出可能编码分泌蛋白的基因；最后通过实验手段对筛选出的基因组进行相关验证。基于蛋白质组学技术的研究策略大致可分为5步，即分泌蛋白的收集或制备、分泌蛋白的分离与鉴定、差异蛋白质的定量检测、生物信息学软件预测及目标蛋白质的验证。前者虽然具有简单、快捷、高效等特点，但由于基因组水平的研究不能完全准确地反映细胞内蛋白质的真实情况^[23]，使得该策略的实用价值大大降低。而后者虽然起步较晚，但由于蛋白质较DNA和mRNA能更准确地反映肿瘤的病理学变化^[24]，伴随着实验技术、蛋白质组学技术及生物信息学的快速发展，该策略已逐渐成为肿瘤分泌蛋白质组研究的主要策略。

4 肿瘤标志物研究中的蛋白质组学技术

目前，已有多种蛋白质生物标志物被用于肿瘤的临床诊断与治疗，其检测与评估主要通过各种蛋白质组学技术。这些蛋白质组学技术可简单分为基于质谱（MS-based）和不依赖于质谱（non-MS-based）两大类^[25]。其中，不依赖于质谱的蛋白质组学技术主要包括蛋白质微阵列、血清蛋白质电泳、蛋白质印迹法（Western blot）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）等^[26]。

作为一种高通量、低消耗、小型化的类似于基因芯片的分析技术，蛋白质微阵列在过去10年中得到了快速发展。通过该技术，研究人员可同时对数以万计的蛋白质进行分析，从而为生物标志物识别、蛋白质相互作用研究等提供了更多选择^[27]。而经过数十年的改进提升，蛋白质电泳、Western blot、ELISA等蛋白质检测技术现已较为成熟。

近年来，实际用于肿瘤标志物、药物靶标等筛选的蛋白质组学技术多以质谱为核心。根据蛋白质分离方法的不同，基于质谱的蛋白质组学技术可分为基于凝胶的方法和不依赖于凝胶的方法^{[10, 25, 26, 28]}。前者包括二维凝胶电泳（2-DE）和差异凝胶电泳（DIGE）；后者主要包括细胞培养稳定同位素标记（SILAC）、同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）、同位素标记的亲和标签（ICAT）、串联质谱标签（TMT）等方法。由于具有高通量、高灵敏度等特点^[29]，这些基于质谱的蛋白质组学技术也能同时处理数以万计的蛋白质，虽然样品中蛋白质的含量很低。因此，许多研究小组利用这些技术以快速准确地识别恶性肿瘤诊断与治疗中的潜在蛋白标志物^[10]。

5 分泌蛋白质组学技术在恶性肿瘤标志物研究中的应用

在恶性肿瘤的研究中，分泌蛋白质组学技术主要应用于筛选肿瘤标志物，探索肿瘤发生发展机制，寻找潜在的肿瘤药物靶点等方面^{[7, 12]}。由于肿瘤标志物的检测不仅在肿瘤诊断、肿瘤发生发展机制研究中具有重要作用，还可为肿瘤的临床治疗提供依据，进而以其为靶点实现肿瘤的靶向及免疫治疗。因此，肿瘤标志物在肿瘤研究中占有十分重要的地位，而肿瘤标志学也发展成为肿瘤学中一个重要的新学科、新领域。分泌蛋白质组学研究最主要的目的就是找到准确、可靠、专一的肿瘤标志物，从而为恶性肿瘤的早期诊断与治疗提供实验依据。通过分泌蛋白质组学技术，近年来已发现了不少可成为肿瘤标志物的分泌蛋白^[30-33]。根据CA期刊在线发布的《2012全球癌症统计》报告^[34]及全国肿瘤登记中心出版的《2014年中国肿瘤登记年报》^[35]，本文将10种最常见的恶性肿瘤潜在分泌性蛋白标志物汇总于表 1中，并对其中5种进行了重点介绍。

5.1 肝癌

肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，因其恶性程度极高，预后极差，被称为“癌中之王”。我国是肝癌最主要的高发区，2012年新增肝癌病例数和死亡病例数约占全球总数的一半^{[34, 108]}。甲胎蛋白（AFP）是肝癌诊断中最主要的指标之一，但临床上约30%肝癌患者的AFP检测结果为阴性，且AFP检测不能准确地区分早期肝癌与慢性肝炎和肝硬化^{[109, 110]}，故寻找灵敏度更高、特异性更强的肝癌标志物已成为肝癌研究的重要课题。Yamashita等^[36]运用2D LC-MS/MS技术从HepG2细胞中发现86个分泌蛋白，其中10个含信号肽的分泌蛋白为最新发现。Zinkin等^[37]采用SELDI-TOF MS技术，通过对41例肝癌患者和51例肝硬化患者间分泌蛋白质组进行比较研究发现，胱抑素C等11个蛋白质表达水平变化明显。以这些蛋白质为标志物组合对肝癌进行联合检测，其诊断的灵敏度和特异性分别高达79%和86%。Wu等^[39]利用1D SDS-PAGE和nano-LC-MS/MS技术对23种癌细胞系进行系统分析后，共识别出4 584个非冗余的蛋白质，其中196个是肝癌细胞独有的。通过对44例肝癌患者和45例健康人蛋白质组进行比较分析发现，肝癌患者血浆中单核细胞分化抗原CD14表达水平明显高于健康人的。此外，根据人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）数据库中得到的数据，CD14在肝癌组织样本中阳性着色率远远高于在其它19种癌症，故推测CD14可能是一种特异性的肝癌标志物。为了识别出有效的肝癌循环生物标志物，Awan等^[45]从7个开放的基因和蛋白质数据库中提取出731个肝特异性的蛋白质。对这些蛋白质的表达谱进行验证分析后，共筛选出20个可作为肝癌标志物的蛋白质，其中6个已被证实为肝细胞癌循环生物标志物。

5.2 肺癌

肺癌是全球最常见，也是导致死亡人数最多的恶性肿瘤^{[34, 111]}。由于其早期症状轻微，且缺乏特异性的生物标志物及早期筛查方法，大多数肺癌患者就诊时已处于晚期，失去了手术机会。因此，找到高灵敏度、高特异性的肺癌标志物，已成为肺癌早期诊断与治疗的关键。Chen等^[46]运用2D-PAGE联合MS技术，通过对93份肺癌组织样本和10份正常组织样本进行比对研究发现，抗氧化酶AOE372、ATP合酶亚基d（ATP5D）等9种蛋白质在肺癌组织样本中显著过表达，表明它们可能是潜在的肺癌标志物。Luo等^[52]运用1DE联合LC-MS/MS技术对A549细胞蛋白质组进行研究后，构建了一个包含382个蛋白质的分泌蛋白数据集。ELISA证实C4b结合蛋白（C4BP）在非小细胞肺癌血清中上调表达。进一步的研究表明，C4BP血清表达水平与非小细胞肺癌的临床分期紧密相关。Yu等^[53]利用1D-SDS-PAGE联合nano-LC-MS/MS技术对肺癌胸腔积液蛋白质组进行研究后，构建了一个包含482个非冗余蛋白质的数据集。为了识别出源自胸腔积液的潜在肺癌标志物，将该数据集与3个肺癌细胞系蛋白质组进行比对分析后，共发现了107个胸腔积液中特有的蛋白质。通过对68例肺癌患者和119例非致命性肺病患者胸腔积液中分泌蛋白质组进行比对研究发现，α2 HS糖蛋白（AHSG）和胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP2）在肺癌患者胸腔积液中水平升高。Na等^[54]利用蛋白质组学技术对肺癌细胞分泌蛋白质组进行分析后发现，斯钙素2（STC2）的表达水平高于邻近正常细胞中的。RT-PCR和Western blot进一步证实肺癌组织中STC2的mRNA和蛋白质表达水平也高于邻近正常组织，表明STC2可能是一种潜在的肺癌标志物，并在肺癌的转移和发展中发挥了重要作用。

5.3 乳腺癌

乳腺癌是女性中最常被检出，也是导致女性死亡人数最多的恶性肿瘤^[34]。目前有关乳腺癌标志物的研究已有很多，而一些标志物也被应用于乳腺癌的临床诊断与治疗，但其灵敏度和特异性仍有待进一步提高。Zhao等^[55]运用2-DE联合MALDI-MS技术对54例正常女性和76例乳腺癌患者血清蛋白质组进行对比研究后发现，乳腺癌患者血清中既有HSP27的上调表达，也有14-3-3 σ的下调表达。以这两个蛋白质为肿瘤标志物组合对104份未知血清样本进行分类，其灵敏度和特异度分别高达100%和97%。Kulasingam等^[59]通过对100例健康女性，50例健康男性及150例乳腺癌患者血清样本进行检测发现，ALCAM的检出率（0.78）高于经典的乳腺癌标志物CA15-3（0.70）和CEA（0.63）的检出率。此外，ROC曲线结果表明，联合检测血清中ALCAM和CA15-3，可进一步提高对乳腺癌的诊断灵敏度。Lai等^[60]利用2D-DIGE联合MALDI-TOF MS技术，从MCF-7，MB-MDA-231和MCF-10A三个细胞系的蛋白质组中发现了50个差异性表达的分泌蛋白，其中IFIT3和MMP2被证实是乳腺癌发展阶段的潜在标志物。Tan等^[64]运用2DE联合图像分析技术从MCF-7乳腺癌细胞系培养基中发现了CPA4、AAT、HSP70和HP 4个糖蛋白，而在正常乳腺上皮细胞（HMEpC）的培养基中则只发现了CPA4和ON 2个糖蛋白。凝集素印迹法分析进一步证实CPA4、AAT、HSP70、HP都是作为N端多糖而被分泌到MCF-7培养基中的，而只有CPA4是作为N端多糖被分泌到HMEpC培养基中，表明糖蛋白可作为糖基生物标志物用于乳腺癌的预后判断。

5.4 前列腺癌

前列腺癌的检出率在男性恶性肿瘤中排第二，其致死率在欧美发达国家恶性肿瘤中位居第三^[34]。我国虽然不是前列腺癌的高发区，但近年来随着我国人口老龄化、饮食结构改变等因素，前列腺癌的发病率和致死率也逐年升高。前列腺癌特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）是目前临床上前列腺癌诊断最有价值的肿瘤标志物，但由于PSA是一个组织特异性而非肿瘤特异性的标志物，其检测结果会受到诸多因素的影响，在改善患者预后方面也存在较大争议^[112]。因此寻找到专一性更强的肿瘤标志物，对于前列腺癌的早期诊断具有重要的临床价值。Zheng等^[65]利用SELDI技术对22例前列腺癌根治术切除标本进行分析后发现，了一个特殊蛋白Pca-24。通过激光捕获显微切割技术（LCM），进一步证实Pca-24的确来自于前列腺癌细胞，表明Pca-24可能是一个有效的前列腺癌标志物。Pan等^[113]采用SELDI-TOF MS对83例前列腺癌患者和95例健康男性血清样本进行比对分析后，发现了18个血清差异性蛋白，其中4个表达水平升高，另外14个表达水平降低。Chen等^[114]运用2DE联合MALDI-TOF MS技术对BPH-1和LNCaP细胞条件培养液中蛋白质组进行分析后，共发现了11个差异性表达蛋白，其中6个上调，5个下调。以这些蛋白质为前列腺癌标志物组合，可有效地区分前列腺癌和良性前列腺增生。Liu等^[71]利用SWATH质谱对10例正常前列腺组织样本，24例非侵略性前列腺癌，16例侵略性前列腺癌，25例转移性前列腺癌组织样本进行比对分析后发现，包括NAAA和PTK7等在内的220个糖蛋白与前列腺癌的侵袭、转移等多种生理过程紧密相关。通过蛋白质微阵列技术对独立样本集进行分析，进一步证实这两个糖蛋白与侵略性前列腺癌存在显著关联，表明NAAA和PTK7可作为潜在的前列腺癌标志物。

5.5 胃癌

在我国恶性肿瘤中，胃癌的发病率位居第二，死亡率位居第三，每年约35万人死于胃癌。目前临床上能用于胃癌诊断与治疗的肿瘤标志物还很少，而专门针对胃癌细胞系条件培养液蛋白质组的研究也不多^[108]。Chong等^[73]运用MS技术结合iTRAQ标记对胃癌动物模型蛋白质组进行研究后发现，α胰蛋白酶抑制因子H3（ITIH3）在胃癌小鼠模型血浆中的表达水平显著高于正常小鼠血浆中的。通过对83例正常人和84例胃癌患者血浆样本进行分析，实验结果表明ITIH3在胃癌患者血浆中的表达水平更高。以ITIH3为胃癌诊断标志物，ROC曲线得到的最佳灵敏度和特异性分别为96%、66%。Loei等^[75]应用2D-LC-MS/MS技术结合iTRAQ标记对胃癌细胞系AGS和MKN7分泌蛋白组进行研究后，共发现了90个在条件培养液中表达水平升高的蛋白质。免疫组化实验表明颗粒体蛋白（GRN）在胃癌组织中频繁表达，而在正常胃黏膜上皮细胞中不表达。ELISA分析进一步证实GRN在胃癌患者血清中的表达水平高于正常人群的，尤其是早期胃癌患者，表明GRN可能是早期胃癌诊断的潜在标志物。Penno等^[76]利用2D-DIGE联合LC-MS/MS技术对胃癌小鼠模型中正常型和肿瘤型分泌蛋白组进行比对分析后发现，28个人类同源蛋白质。以其中8个蛋白质为胃癌诊断的标志物组合，ELISA分析证实载脂蛋白E和结合珠蛋白在胃癌患者血清中表达水平显著升高，而afamin和丛生蛋白则明显降低。ROC分析结果进一步表明这4个蛋白质对于胃癌诊断的灵敏度和特异性可能要优于现有的胃癌检测标志物CA72-4。Wu等^[78]利用2D-DIGE联合Western blot、免疫组化技术对胃癌组织样本及其邻近正常组织样本进行比对分析后发现，GRP78、GSTpi、ApoAI、A1AT和GKN-1等5个蛋白质可作为有效的胃癌标志物组合。实验结果表明，GRP78、GSTpi在胃癌组织中显著上调表达，A1AT显著下调表达。此外，GRP78和ApoAI的表达水平与A1AT紧密相关。

6 展望

分泌蛋白是潜在的肿瘤标志物及药物靶标等的主要来源，已成为肿瘤研究中的热点和难点问题。由于具有灵敏度高、特异性强、复现性好、高通量、简单、快捷等特点，基于质谱的蛋白质组学技术在过去十年中发展迅速，并在肿瘤标志物的筛选与鉴定、肿瘤分类与发生发展机制、治疗与预后评估等方面承担起越来越重要的角色。近期的研究还表明，多种肿瘤标志物联合检测的灵敏度和准确度较单一标志物检测更高^{[83, 115]}。尽管蛋白质组学方法在肿瘤研究的各个领域都取得了显著成效，但目前仍存在诸多困难与问题。蛋白质组学方法虽然能同时识别成千上万的蛋白质，但检测结果往往偏向于可溶性和高丰度的蛋白质，而容易错过许多低丰度的具有重要生理功能的蛋白质。肿瘤的异质性是恶性肿瘤的特征之一^[116]，故即使在同一类型的恶性肿瘤中，也很难找到通用的蛋白标志物。此外，药物研发的速度远远滞后于新的药物靶标的发现速率，而药物靶标的发现同样来自于大量的蛋白质组学研究。因此，虽然蛋白质组学技术目前已筛选出大量肿瘤诊断、治疗及预后的蛋白标志物，但其中只有很少一部分能应用于临床。今后对于肿瘤标志物的研究应更注重其功能性研究和临床试验，以期获得更快的检出速度和更高的检测成功率。在恶性肿瘤靶向和组合疗法的临床前与临床研究中，蛋白质组学技术有望发挥越来越重要的作用^[25]。