微小RNA（microRNA，或miRNA）是一类长为19-24 nt的内源性非编码RNAs，普遍存在于真核生物及病毒中，在转录后基因沉默（PTGS）中发挥重要作用^[1]。miRNA是在生物体内形成、通过与外源mRNAs的序列互补配对而识别靶基因，降解靶mRNA或抑制基因翻译，最终抑制目的基因表达^[2]，并参与植物器官的形态建成^[3]、激素感知应答与信号转导^[4]、植物生长发育^{[5, 6]}和RNA代谢^{[7, 8]}等过程的调控。miRNA于1993年首次在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中被发现^[9]。此后，大量的研究表明在动物和植物界均存在miRNA家族^[9-11]。PTGS传统研究方法是基于不同方式导入植物体内的双链小分子RNA（dsRNA），衍生出小分子干扰RNA（siRNA）抑制RNA沉默，揭示PTGS途径中的基因功能。我们所熟知的病毒诱导的基因沉默（VIGS）就是将病毒基因组作为载体，在植物上建立有效的基因沉默体系^[12]。尽管这些方法具有一定优势，但作为沉默体系的病毒载体鉴定还是工作中的难点。随着miRNAs的深入研究，为克服上述难点且有效沉默靶基因提出了一种新方法，即人工miRNA（amiRNA）技术^{[13, 14]}。

1 植物miRNA的合成和作用机制

miRNA介导的基因沉默是一种古老的基因调控机制，是在转录后水平发生的，由细胞核内转录的mRNA进入细胞质后，与具有同源的植物体内源基因或入侵的同源病毒核酸形成了特异的结合并发生了核酸的降解。miRNA在进化过程中表现出很高的结构保守性。基因沉默是个复杂的过程，首先由双链RNA（dsRNA）所引发，dsRNA被具有RNaseⅢ活性称为Dicer的RNA酶（DCLs）识别并切割成21-25 nt的小片段干涉RNA（siRNA）或microRNA（miRNA）。随后这些小分子RNA整合到一种称为RNA诱导的沉默复合体（RISC）中，并通过碱基配对原理引导RISC特异性剪切靶mRNA或阻遏靶mRNA的正常翻译，从而使目的基因发生沉默。dsRNA可以是内源的，如转座子插入、RNA病毒的复制、转基因的转录本等，也可以通过实验的方法外源导入。

参与基因沉默的miRNA来源于内源基因，由RNA聚合酶Ⅱ进行转录，首先由长的内源性转录本（pri-miRNA）生成70 nt左右的miRNA前体（pre-miRNA），含有5'帽子和3' poly（A）尾巴。pre-miRNA发夹在依赖性Exportin-5机制作用下被输出到细胞质中，随后在Dicer酶（DCL1）的作用下使其加工成为一个不稳定的miRNA/miRNA^*二价体，接着整合到RISC，成熟的miRNA链保留在RISC里，并通过与靶位点碱基互补识别和指导mRNA的剪切（在植物上）或抑制其翻译（在动物上），另一miRNA*被降解^{[15, 16]}。miRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用，同时还参与了逆境应答与激素调节和病毒侵染下基因沉默调控^[16-18]。

植物miRNA与靶标mRNA的序列完全或几乎完全互补（0-5个错配碱基）时，RISC通过切断miRNA与mRNA形成双链的第10与11个碱基，从而降解靶mRNA。相反，当植物miRNA与靶标mRNA不完全互补时，RISC则通过抑制靶mRNA翻译进行基因调控。此外，miRNA也可以通过甲基化方式在转录水平进行调控^{[19, 20]}。在细菌侵染植物时，植物生长素信号相关的调节蛋白和转录因子的miRNAs呈现上调，并抑制了生长素信号，因此在对抗病原菌侵染时诱导出了寄主植物防御机制^[21]。虽然植物病毒可以通过编码沉默抑制子拮抗植物的防御机制（RNA沉默）^[22]，但是，有研究表明一些植物内源miRNAs能够靶标病毒抑制子的转录本使得植物能够抵抗病毒侵染。miRNAs在转录后水平的非生物胁迫响应调节中也发挥着重要作用^[23]。大多数植物miRNAs靶标的是在种子萌发到种子成熟发育过程参与的转录因子^[24]，这些miRNAs同时也调控植物逆境胁迫响应。靶标各种非生物胁迫相关的转录因子和调控蛋白的保守miRNAs在胁迫期间显著地上调或者下调。例如，miR395和miR399分别在硫酸盐和磷酸盐缺乏的环境下过量表达^{[4, 25]}。

2 人工miRNA干扰技术 2.1 人工miRNA简介

人工miRNAs是基于内源的miRNA前体设计，以miRNA前体作为基本骨架。由于一个miRNA前体只生成一个sRNA二价体，即miRNA/miRNA^*二价体，将miRNA/miRNA^*二价体区域的序列替换为与靶基因序列互补的特异miRNA，则产生具有新功能的人工miRNA^[26]。只要人工miRNA前体的二级折回结构保持原样，它与内源miRNA前体的生物学功能将会一致^{[27, 28]}。因此，对于基因功能的分析和鉴定，人工miRNA技术能够通过选择感兴趣的一个或多个靶基因进行设计。同时，人工miRNA序列应与选择被沉默的植物基因具有较低同源性以避免产生脱靶效应^{[29, 30]}。

2.2 人工miRNA特点

人工miRNA技术的本质是利用生物体内源的miRNA前体为基本骨架，将其保守且互补的一段序列替换成目的片段，按照miRNA形成过程，产生能够沉默目的基因的小RNA分子^[29]。miRNA前体优先产生miRNA/miRNA^*二价体。当两边序列不匹配或凸起时，通常会产生所需序列的miRNA高度富集。2004年Parizotto等^[31]在拟南芥中的研究，证明人工miRNA技术成功干扰了报告基因GFP的表达。随后，研究表明人工miRNA不仅能干扰报告基因，也可靶标内源的基因，且在其他植物上同样有效^{[14, 32]}。此外，植物人工miRNA具有类似于内源miRNA的高度特异性^{[14, 33]}，这样优化的人工miRNA序列就能特异地沉默一个或多个靶标转录本。

2.3 植物人工miRNA的设计

Schwab等^[14]于2006年开发了一套免费开放的人工miRNA在线设计软件（http://wmd3.weigelworld.org），可适用于250多种植物的人工miRNA序列设计。对于完全注释的基因组，如拟南芥和水稻，只需要在WMD平台的Design工具输入基因的登录号即可。对于个别拼接的序列或无登录号的情况则需要输入其fasta格式的序列，点击提交后即可自动设计。为了使得人工miRNA在植物体内能够高特异性地沉默目的基因，对于人工miRNA设计的优化，需要满足几点：（1）第一个碱基为U；（2）第10个核苷酸为A或者U；（3）第13位和第21位碱基之间最多只能有4个碱基错配，且不能有2个碱基连续出现；（4）第10和第11位碱基上不能出现碱基错配^[29]；（5）尽可能在全基因组范围内考虑人工miRNA与mRNA的关系，减少人工miRNA的非特异性^[22]；（6）人工miRNA靶位点不选择在较易形成复杂高级结构的区域。总之，通过在线设计软件生成的人工miRNA序列在具体实践中还需进一步筛选和优化。

2.4 人工miRNA载体构建

Schwab等提出的重叠PCR法构建植物人工miRNA载体因操作简便、快速、准确性高而成为目前最常用的方法之一。WMD平台包含的“Oligo”工具可自动产生基于拟南芥miR319（或水稻miR528）前体的4条寡核苷酸引物（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。重叠PCR法基于人工miRNA前体序列组成，通过在WMD在线软件上设计的3对引物（A/V、Ⅱ/Ⅲ和I/B）分别扩增前体序列5'端到miRNA位点、miRNA位点到miRNA^*位点和miRNA^*位点到前体序列的3'端。以天然miRNA前体的DNA为模板进行3次PCR扩增，再以纯化后的3次PCR产物为模板，A/B为上下游引物进行第4次PCR扩增，即得到了人工miRNA基因（图 1）。最后，通过分子克隆手段将其连接至合适的表达载体中进行遗传转化。

除了重叠PCR方法外，很多研究者也提出了自己的构建方法，如Niu等^[34]采用一步PCR方法构建人工miRNA基因，Ossowski等^[29]提出了基于尿嘧啶切除的克隆法^[35]，以及Liu等^[36]提出的加入酶切回收小片段的一种新的构建方法。但不同的方法操作起来复杂程度不同，且有些方法改变了天然miRNA前体的长度，是否会影响其在植物体内的功能及沉默效果仍未可知。

3 人工miRNA在植物抗病育种上的应用

人工miRNA是通过与宿主基因组比对，选择只生成一段21 nt的siRNA，因而能有效避免传统RNAi方法引起的脱靶效应。同时，人工miRNA不存在与侵染植物的非靶标病毒基因组发生重组的风险，因此利用人工miRNA技术靶向病毒基因可以获得更安全、高效、广谱的抗病毒转基因植物。此外，田间病毒多是混合侵染，且病毒变异较快，而人工miRNA允许错配存在，因此针对病毒保守区设计的人工miRNA，能有效抑制大多数病毒株系，且当病毒发生突变后仍然保持抗病能力^{[37, 38]}，既能延长品种寿命，又能防止病毒变异的积累产生新毒株，对培育持久广谱的抗病毒品种具有重要意义。

人工miRNA技术最早被用于哺乳动物细胞系^[39]，而在植物上的首次应用是2004年用于模式植物拟南芥^[31]。随后，人工miRNA在拟南芥、烟草、番茄、水稻、茄子及木薯等植物上特异性沉默目的基因表达的研究陆续被报道^{[34, 38, 40-43]}。黄军艳等^[44]将At3A06基因的人工miRNA载体遗传转化拟南芥，得到了对菌核病敏感性显著增强的后代转基因株系。人工miRNA在植物抗病育种上具有潜在的巨大影响，特别是针对植物病毒抗性的人工miRNA应用已经被广泛研究^{[14, 34]}。例如，Niu等^[34]将芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的HC-Pro基因和芜菁黄花叶病毒（Turnip yellow mosaic virus，TYMV）的P69基因替换拟南芥的miR159a骨架的保守片段，构建了两个人工miRNA载体，结果表明，这两个人工miRNA能特异性沉默靶基因的表达，并稳定遗传给后代。靶向黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）沉默抑制子2b基因的人工miRNA载体遗传转化番茄，获得的转基因番茄植株能有效抵抗CMV的侵染^{[45, 46]}。此外，若是将不同病毒基因的人工miRNA的前体骨架遗传转化至同一植物中，可以同时获得多种病毒的抗性。Ai等^[28]将靶向沉默抑制子HC-Pro（PVY）和p25（PVX）的人工miRNA导入烟草（Nicotiana tabacum），转基因烟草明显提高了对这两种病害的抗病性。Song等^[38]设计了基于PVY和烟草蚀纹病毒（Tabacco etch virus，TEV）Nib和CP基因的人工miRNA，结果显示转基因烟草对这两种病毒同时具有抗性。

然而，人工miRNA技术在农业应用方面也可能遇到障碍，尤其是在抗病毒转基因分子育种上，这是因为病毒基因组比植物miRNAs进化得更快，病毒能够通过突变等方式改变靶区域的保守性，造成人工miRNA的脱靶^{[47, 48]}。解决方法可采用基于病毒多个高度保守区域的多重人工miRNAs表达。Duan等^[49]靶向黄瓜花叶病毒（CMV）的2b蛋白编码区和基因组3'端非编码保守区设计多重人工miRNA干扰载体，结果表明转基因拟南芥对3个CMV病毒亚组的毒株具有高度抗性。

4 展望

植物基因沉默技术是植物遗传改良一个重要的操作工具，人工miRNA具有高效、精确、可控和安全的优点，在培育抗病毒植株、建立基因组突变库和多拷贝基因与基因家族的研究等领域具有特别优势。人工miRNA可在组成型或组织特异性启动子控制下在活体细胞内高效表达，选择性沉默一个或多个靶基因^{[14, 31]}。人工miRNA骨架是影响其表达效果的因素之一，有些miRNA前体作为骨架可以在不同植物中应用，如拟南芥miRNA前体在烟草、番茄等植物上的应用提高了其抗病性^{[14, 32, 34]}。传统的RNA干扰（RNA interference，RNAi）过程中，siRNA可能非特异性地结合与其序列互补性高的非靶基因，从而阻断非特异基因的表达，即产生siRNA的脱靶效应。而人工miRNA允许一定数量的碱基错配，且人工miRNA长度仅为21 nt，能有效避免传统RNAi抗病毒策略引起的脱靶效应^[50]。然而，人工miRNA在植物体内是否均能按照预期的加工机制干扰靶基因mRNA，有些植物基因组信息缺乏而难以在基因组内考虑人工miRNA的沉默效应，生物体复杂的调控机制对人工miRNA作用效率的影响等，这些方面还不是完全清楚，仍有待进一步研究。而人工miRNA技术的可设计性和靶标特异性充分体现了该技术在植物抗病育种上的有效性和多功能性，并已在多种植物中得到应用。随着越来越多的内源miRNA的发现以及其作用机制的不断深入研究，人工miRNA技术将不断得到完善，并在植物领域中发挥更大作用。另外，CRISPR/Cas9是新一代基因组编辑技术，可以实现定向改造植物基因组上一个或多个基因，为植物的遗传改良提供了新的途径。利用基因编辑技术对染色体大片段的缺失，可以快速敲除控制不良性状的基因簇，实现作物的快速遗传改良^[51]。