α-芋螺毒素是烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）的拮抗剂，而乙酰胆碱结合蛋白（AChBPs）与nAChRs的胞外配体结合结构域同源性较高，AChBPs与nAChRs的药理特性和离子通道激活机制相似，因此AChBPs通常作为研究nAChRs的结构模板^{[1, 2]}。多个AChBPs的x-ray结构已被解析，通过其晶体结构，我们更清楚了解nAChRs的结构。AChBPs有3种，分别是Lymnaea stagnalis、Aplysia californica、Bulinus truncatus，简称为Ls-AChBP、Ac-AChBP、Bt-AChBP，它们结构相类似^{[3, 4]}，α-芋螺毒素主要与Ac-AChBP结合。α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶结构不仅帮助我们剖析nAChRs的生理和病理功能，而且有助于发现药效更好的α-芋螺毒素^{[4, 5]}。

目前已有5个α-芋螺毒素与AChBPs共结晶结构被解析，它们分别是PnIA（A10L D14K）（PDB：2BR8）^[5]、ImI（PDB：2C9T，2BYP）^{[6, 7]}、TxIA（A10L）（PDB：2UZ6）^[8]、BuIA（PDB：4EZ1）和GIC（PDB：5CO5）^[9]与Ac-AChBP共结晶的结构。其中GIC与Ac-AChBP的复合物结构是我们报道的分辨率较高的共结晶结构。α-芋螺毒素GIC是从杀手芋螺（Conus geographus）中发现的作用于α3β2 nAChRs的毒素。α3β2 nAChRs是位于脑部的神经受体，与记忆、认识相关。α-芋螺毒素GIC作用于α3β2 nAChRs的IC50最低浓度为1.1 nmol/L，是目前发现最强作用于α3β2 nAChRs的毒素，这一点使它的结构与功能倍受关注，另外，它与Ac-AChBP结合的IC50值也较低（29 nmol/L），它与Ac-AChBP的共结晶的方法可为其他新型α-芋螺毒素与Ac-AChBP或nAChRs共结晶提供借鉴，为开发治疗疼痛、成瘾、帕金森症、阿尔茨海默氏症和癫痫等与nAChRs相关疾病的药物提供理论依据^[9]。

蛋白结构的解析关键是要获得高分辨率的蛋白晶体。要获得高质量的蛋白晶体，必须对蛋白结晶条件进行筛选与优化^[10-12]。蛋白结晶过程通常是把沉淀剂（池液）加到蛋白质溶液表面，沉淀剂从蛋白质溶液中吸走水分而引起蛋白结晶。结晶条件是指不同的沉淀剂及其摩尔浓度、pH值等因素。这些条件（因素）有上万种，因此需要利用机器人进行对结晶条件的大量筛选和优化，才能得到分辨率高的晶体。本研究采用正交实验，并利用机器人及HAMPTON RESEARCH试剂盒对α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶条件进行筛选与优化，以期获得高分辨率的晶体。

1 材料与方法 1.1 材料

Ac-AChBP（AChBP from Aplysia californica）基因^[13]根据NCBI提供的序列（NM_001204599）设计并由上海生工公司合成，在两端分别引入BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位点。大肠杆菌宿主菌DH10Bac，昆虫表达载体pFastBac1，昆虫细胞Sf9（Spodoptera frugiperda），HAMPTON RESEARCH结晶试剂盒PEG/Ion1，PEG/Ion2，Index，Crystal Screen，SaltRX等由本实验室保存。

1.2 方法 1.2.1 蛋白表达与纯化

在昆虫细胞中分泌表达Ac-AChBP，分泌表达的培养基上清液经镍柱纯化后，用凝胶色谱进一步纯化。本实验所用凝胶色谱柱是superdex200（GE Healthcare），利用AKTA（GE Healthcare）系统分离纯化，流动相HBS溶液（10 mmol/L Hepes，150 mmol/L NaCl，pH7.2）流速为1 mL/min，将蛋白样品浓缩到1 mL后上样，利用AKTA程序过柱，自动收集样品。将收集样品利用SDS-PAGE检测，并用液氮速冻后置于-80℃保存^[13-16]。

1.2.2 α-芋螺毒素GIC的合成与纯化

α-芋螺毒素GIC由上海吉尔生化公司合成，并用C18柱（Vydac，Hesperia，CA，USA）经高效液相色谱纯化，收集纯化的样品（与标准品比较达到99.8%）冷冻干燥备用^[9]。

1.2.3 Ac-AChBP蛋白结晶

将纯化的Ac-AChBP浓缩至约20 mg/mL。使用液-液扩散法在291 k长晶体。具体如下：在96孔板中，用HAMPTON RESEARCH试剂PEG/Ion1，PEG/Ion2，Index，Cystal Screen，Sa-ltRX当池液，用结晶机器人CRYSTAL GRYPHON（Art robbins instrusmets）点样，将浓缩蛋白液与池液按1:1点坐滴，点样量为0.15 μL，在显微镜下观察晶体生长^[9]。

1.2.4 α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶

α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶前，先把它们混合，然后把混合好的溶液去点晶体。已知1 mol Ac-AChBP亚基与1 mol α-芋螺毒素结合（虽然理论上它们按摩尔比1:1结合，但为了使α-芋螺毒素能充分结合到Ac-AchBP中，把α-半螺毒素的量增加了10倍）。利用ExPASy Protparam tool分析Ac-AChBP吸光指数为1.5，其分子量为27 kD，取出Ac-AChBP蛋白储备液（浓度为1.0 mg/mL）1 mL。按以下公式计算Ac-AChBP蛋白亚基储备液的mol数为：

α-芋螺毒素GIC的C端已酰胺化，其分子量为1 610.4 kD，用纯化的α-芋螺毒素GIC重量除以其分子量可得到GIC的摩尔数。把α-芋螺毒素GIC按摩尔比为10:1与Ac-AChBP亚基共混。把混和液在室温放置2 h使其结合，然后13 000 r/min离心15 min，再用凝胶色谱纯化。收集Ac-AChBP与α-芋螺毒素结合的凝胶纯化色谱峰片段，将其浓缩至约20 mg/mL。使用坐滴蒸气扩散法在291 k长晶体，点完晶体后，在显微镜下观察到晶体生长^[13-16]。

2 结果 2.1 Ac-AChBP的制备

在昆虫细胞中分泌表达Ac-AChBP，并用凝胶色谱纯化。Ac-AChBP的凝胶纯化色谱（图 1-A）显示，其出峰位置在12.5 mL，根据Superdex200柱的说明，峰位置为12.5 mL表示约为135 kD的相对分子量。从不同的峰位置a-d收集组分作进一步的SDS-PAGE胶分析（图 1-B）。图 1-B中a-d是Ac-AChBP蛋白非变性的SDS-PAGE胶图，即上样时，没有加还原剂和煮沸样品。Ra-Rd所示是变性的SDS-PAGE胶图，即上样时，加还原剂DDT和煮沸样品5 min。a-d条带在SDS-PAGE胶顶部（图 1-B），显示它们非变性状态是五聚体，因为其是球状蛋白，电泳图只显示分子量为116 kD，比实际线型分子量（135 kD）要小。R a-d所示是变性的Ac-AChBP，其由五聚体变为单体，分子量约为27 kD；正好是表达出来的重组蛋白五聚体分子量的1/5，这一点也说明变性的Ac-AChBP状态为单体。活性状态为五聚体。

2.2 Ac-AChBP结晶及优化

在研究α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶条件之前，先研究Ac-AChBP的结晶条件。原因是共结晶中Ac-AChBP是个五聚体的大蛋白，而α-芋螺毒素GIC只结合在Ac-AChBP上的小多肽。因此Ac-AChBP结晶的条件是研究共结晶的前提。Ac-AChBP结晶条件可以借鉴在共结晶中。

利用机器人初步筛选Ac-AChBP的结晶，选用结晶试剂盒PEG/Ion1，PEG/Ion2，Index，Crystal Screen，Wizard 1，SaltRX均能得到晶体，把得到的晶体送往上海同步辐射光源收集数据，SaltRX的4个条件（表 1和图 2）得到的晶体分辨率较好。在这4个条件中，15号（图 2-A）晶体条件得到的晶体数据最好，分辨率为3 Å。

接着对15号晶体条件进行优化，优化实验设计如表 2所示，对36个结晶条件进行实验（两因素，六水平），并把得到的晶体送去收集数据，其中最好的晶体数据分辨率为2.4 Å，其生长条件为：0.8 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.6。

2.3 α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶 2.3.1 α-芋螺毒素与Ac-AChBP结合

得到2.4 Å的Ac-AChBP晶体后，进一步研究其与α-芋螺毒素共结晶，共结晶前，先把它们共结合，结合的方法按1.2.4所示，α-芋螺毒素与Ac-AChBP结合后，用凝胶色谱纯化。图 3-A蓝线显示Ac-AChBP与α-芋螺毒素GIC结合的凝胶纯化色谱，红线是结合前的Ac-AChBP。图中蓝线比红线分子量大，说明Ac-AChBP已与α-芋螺毒素GIC结合。图 3-B是收集图 3-A蓝线峰组分进行SDS-PAGE胶分析，条带1是活性五聚体Ac-AChBP结合α-芋螺毒素GIC，其分子量显示为100-130 kD之间。而条带2是变性的蓝线组分，变性后，五聚体Ac-AChBP变为单体，分子量为27 kD。变性后，α-芋螺毒素GIC也解离出来，显示在SDS-PAGE胶底部。

2.3.2 α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶

收集以上共结合的凝胶色谱片段（蓝线峰部分），用机器人去点样长晶体，结晶池液采用优化Ac-AChBP晶体所得的的条件：0.8 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.6，也得到α-芋螺毒素GIC与Ac-AChBP共结晶的晶体，但由于受α-芋螺毒素GIC的影响，其晶体长得不如Ac-AChBP好，还需进一步优化。

优化采用以上优化Ac-AChBP的方法（表 2），即改变不同沉淀剂的浓度和pH值，以期获得高质量晶体。表 2优化条件下长出的共结晶晶体如图 4所示（遴选），把优化条件下长出来的晶体送往上海同步辐射光源收集数据，其中最好的共结晶数据分辨率为2.1 Å，晶体如图 5所示，其生长条件为0.6 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.8。收集一套完整的数据，经HKL2000处理后数据其他指标也较好。

3 讨论

目前已发表的α-芋螺毒素与AChBPs共结晶结构采用的结晶条件都有所不同，PnIA（A10L D14K）采用的结晶条件是：17%-18%（W/V）PEG 3350，170-200 mmol/L Na₂SO₄，100 mmol/L Bis-Tris propane，pH7.5^[5]；TxIA（A10L）采用的结晶条件是：20% polyethyleneglycol 3350 and bistrispropane at pH8.5^[8]；ImI在两个条件都得到晶体，它们分别是：11%-14% PEG-4000，0.1 mol/L Tris，pH7.5^[6]和100 mmol/L sodium acetate（pH5.5）and polyethylene glycol 5000 monomethylether^[7]；我们也在两个条件下得到GIC的共结晶，分别是：1.5 mol/L lithium sulfate monohydrate，0.1 mol/L Tris，pH8.5^[9]和0.6 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.8。以上看出，不同的α-芋螺毒素与AChBPs共结晶其结晶条件不同，同一α-芋螺毒素得到高分辨率的结晶条件也可以是多个。结晶条件千变万化，这可能与结晶的方法及蛋白的性质、纯度、缓冲液等因素有关。

本实验采用的结晶方法是液-液扩散法（Liquid-liquid diffusion），其原理如图 6所示，当把沉淀剂滴加到蛋白质溶液表面，它通过与蛋白质溶液接触面扩散到蛋白质溶液中，沉淀剂从蛋白质溶液中吸走水分，从而使蛋白质溶液浓度不断增大。因此在两溶液接触面形成浓度梯度，随着沉淀剂扩散进入的量越多，蛋白质溶液浓度就越大。蛋白质由不饱和溶液变成饱和溶液，再变成过饱和溶液，从而开始结晶^[10]。

我们利用LtIA、TxIB、LvIA、TxID、RegIA、GIC等多种α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶^{[9, 17-20]}，在以上条件下有LtIA、LvIA和GIC得到共结晶晶体。优化后GIC分辨率较高，LtIA和LvIA共结晶晶体的优化条件待进一步探讨。不同的α-芋螺毒素对Ac-AChBP结晶影响，需要不同的结晶条件才能得到分辨率高的晶体。另外，每种α-芋螺毒素的溶解度不同，它们的溶解度对共结晶也有影响。

共结晶前采用浓度较稀的Ac-AChBP蛋白液与浓度较稀的α-芋螺毒素溶液先共混好，这种方法可以使α-芋螺毒素更好溶解，因为它们先混合在较稀的溶液中，结合后还要经过凝胶色谱纯化，所以这种方法不仅使Ac-AchBP和α-芋螺毒素充分溶解和结合，还可以除去α-芋螺毒素冻干粉中的杂质对结晶的影响。

我们试用另外一种共结晶方法，即把得到的Ac-AChBP晶体浸泡在α-芋螺毒素溶液中，浸泡时间为两周，观察α-芋螺毒素能否结合到晶体内部。但晶体送往上海同步光源收集数据后，分析结果显示α-芋螺毒素没有结合上Ac-AChBP，这说明α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶的方法最好还是Ac-AChBP与α-芋螺毒素溶液先混合好再结晶，这样它们才容易结合并共结晶。

我们先研究Ac-AChBP蛋白的结晶条件，然后在此基础上再研究共结晶条件，可以避免浪费α-芋螺毒素，而且还可以分析每种α-芋螺毒素对共结晶条件的影响。

4 结论

本研究表达与纯化海兔乙酰胆碱结合蛋白（Ac-AChBP），并把它与α-芋螺毒素GIC共结晶，采用正交实验，并利用结晶机器人及HAMPTON RESEARCH试剂盒对其结晶条件进行筛选与优化，在0.6 mol/L Ammonium citrate dibasic，0.1 mol/L Sodium acetate trihydrate pH4.8的条件下生长出较好质量的晶体，其分辨率达到2.1 Å。