2. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081;
3. 四川大学生命科学学院，成都 610065;
4. 中国人民大学附属中学，北京 100080
2. Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;
3. College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065;
4. The High School Affiliated to Renmin University of China, Beijing 100080
干旱、氧化、高盐、辐射和极端温度等非生物胁迫产生的大量活性氧分子（ROS）造成细胞内蛋白质、脂类、碳水化合物和DNA等生物大分子的损伤，严重影响生物体正常的代谢进程[1-3]。据文献报道，耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）可通过其体内的抗氧化酶促防御系统清除ROS，从而降低ROS对细胞的毒性，减轻氧化胁迫，其抗氧化酶促防御系统主要包括：过氧化氢酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶（Peroxidase，POD）等抗氧化酶[4-6]。铁是生物体生长发育所必需的矿物质元素，是生物体中众多反应酶的辅因子和呼吸链的重要组成成分[7-9]，并能对生物体抗氧化酶的活性造成不同程度的影响[10]。然而，高浓度的铁在生物体内具有毒性，对生物体的生长具有抑制作用，生物体内的Fe2+很容易与过氧化氢等发生反应产生OH·和O2·-等活性氧，对生物体造成氧化损伤[9, 11]，在氧化胁迫和铁代谢相互交织的情况下，CAT、SOD和POD等抗氧化酶的活性受到明显的抑制，清除ROS的能力下降。
铁蛋白（Ferritin）广泛存在于动物、植物和细菌体内，具有抗氧化胁迫、调节铁代谢平衡和消除部分重金属等有毒分子的毒害作用[12-15]，能同时去除过氧化氢胁迫和Fe2+所导致的细胞毒性[16, 17]。铁蛋白是一类由24个4股螺旋束结构单体亚基组成的高度对称的球型外壳蛋白，具有铁氧化还原酶中心，能够截获细胞间Fe2+并使其与铁氧化酶结合，将其氧化为Fe3+后以水合氧化铁矿物质的形式储存于蛋白内部空腔中[18]，每分子蛋白空腔内最多可以贮存4 500个铁原子，因此能够保护抗氧化酶类使其活性不受铁的抑制，并保护细胞免受氧化损伤。目前关于铁蛋白结构和功能的研究已有报道，例如，关于耐辐射异常球菌中由二聚体组成的Dps家族铁蛋白功能的研究等[8]。
据文献报道，耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）中drB0118基因编码的蛋白为铁蛋白，与氧化、高盐和干燥等胁迫抗性相关[19-22]，我们将其命名为DrfE（Deinococcus radiodurans Ferritin）。刘盈盈等[22]对非生物胁迫条件下drfE基因的功能进行了初步探索，结果显示该基因的缺失导致耐辐射异常球菌对高盐和氧化胁迫敏感。为了验证并进一步研究DrfE蛋白在非生物胁迫下的抗逆功能及作用机制，本研究构建回补菌株pdrfE∷Δ，验证drfE在细胞耐受高盐和氧化胁迫抗性中的作用，分析氧化胁迫下drfE基因的缺失对耐辐射异常球菌体内CAT、SOD和POD酶活性的影响，探讨DrfE蛋白在抗氧化及耐盐过程中的作用，旨为进一步研究该菌的非生物胁迫抗性机制提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株质粒和培养条件野生型耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans，DR）购自于中国科学院微生物菌种保藏中心；突变株ΔdrfE由本实验室保存；高频转化受体菌大肠杆菌Escherichia coli trans 109购自北京全式金生物技术有限公司；pJET1.2/Blunt克隆载体购自Thermo公司；质粒pRADZ3由本实验室保存。大肠杆菌于LB培养基（1% Typtone，0.5% Yeast extract，1% NaCl，pH7.0，固体培养基含1.5%琼脂）中37℃条件下培养，耐辐射异常球菌于TGY培养基（1% Typtone，0.5 % Yeast extract，0.1% Glucose，固体培养基含1.5%琼脂）中30℃条件下培养。
1.1.2 主要试剂限制性内切酶、T4 DNA连接酶等购于New England Biolabs公司；细菌基因组提取试剂盒购自北京天根科技有限公司，常规质粒提取试剂盒、胶回收纯化试剂盒购自Magen公司；氨苄青霉素和卡那霉素等试剂购于上海生工生物工程公司；H2O2、愈创木酚、氮蓝四唑等抗氧化酶活测定所需试剂购于碧云天生物技术公司；其他生化试剂均为分析纯。引物合成和基因测序均由华大基因完成。
1.2 方法 1.2.1 DrfE蛋白的生物信息学分析从NCBI中获取耐辐射异常球菌drfE基因序列及其编码蛋白DrfE的氨基酸序列信息，运用SMART（http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1）在线工具对蛋白质结构域进行分析；用BLASTP程序获得与DrfE具有一定相似度的大肠杆菌（E. coli）等物种的蛋白序列，通过MEGA软件对其进行序列比对分析。
1.2.2 功能回补菌株pdrfE∷Δ的构建从NCBI数据库中获取drfE基因及其上游区域300 bp的序列（包含预测的启动子区），利用Primer Premier 5.0设计引物pdrfE-F：5' -GCTCTAGAGCATCATCGTGCAGGGCCT-3' （划线序列为Xba Ⅰ酶切位点），pdrfE-R：5' -CGGGATCCTTACAGGCTGAGAATACTG-3' （划线序列为BamH I酶切位点），引物由华大基因合成。以D. radiodurans基因组DNA为模板，使用pdrfE-F/R引物扩增目的片段pdrfE，扩增产物长度为1 314 bp。PCR反应条件是：95℃预变性10 min；95℃变性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min。
通过PCR产物回收完整的drfE基因，连接pJET1.2/Blunt克隆载体，构建pJET-drfE重组质粒，转化E. coli trans 109，挑取阳性转化子测序。提取测序正确的重组pJET-drfE质粒，用BamH Ⅰ和Xba I酶切，同时用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切穿梭质粒pRADZ3，纯化回收1 214 bp的drfE基因片段和6 kb的Z3载体，并将回收的基因片段与pRADZ3载体连接，转化E. coli trans 109，在含有50 μg/mL Amp的LB平板上筛选，获得阳性转化子。重组质粒Z3-drfE进行菌落PCR验证和Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切验证并测序。提取测序正确的重组质粒Z3-drfE，线性转化至突变株ΔdrfE中获得回补菌株pdrfE∷Δ。
1.2.3 不同浓度H2O2和NaCl对菌株的冲击实验将活化的野生型WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE∷Δ转接于20 mL TGY液体培养基中，30℃、220 r/min培养至对数初期（OD600=0.6-0.8）。分别取1 mL野生型WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE∷Δ菌液于1.5 mL EP管中。对于H2O2冲击实验，加入30% H2O2母液使其终浓度分别为0、60、80 mmol/L，混匀后30℃、220 r/min暗处理30 min。对于NaCl冲击实验，5 000 r/min离心5 min收集菌体，菌体分别用1 mL 4 mol/L NaCl和1 mL 5 mol/L NaCl重悬，对照组用无菌水重悬，30℃，220 r/min处理6 h。立即用无菌水进行梯度稀释，每个梯度各取10 μL点在TGY固体培养基上，30℃培养1-2 d后观察菌落形成情况。实验进行3次重复。
1.2.4 细胞内铁离子含量的测定培养野生型WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE∷Δ菌株至对数生长初期（OD600=0.6-0.8），收集1 L菌量，用PBS清洗2次（1 mmol/L EDTA，pH7.4），菌体烘干后采用ICP-MS的方法测定总Fe2+的含量[23]。测定之前将缓冲液作为对照，收集菌体的过程中所有器皿均用10%以上的硝酸浸泡过夜。
1.2.5 体内抗氧化酶活的测定培养野生型WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE∷Δ菌株至对数生长初期（OD600=0.6-0.8），加入终浓度分别为0、60和80 mmol/L的H2O2溶液，在30℃、220 r/min分别处理15 min、30 min，然后分别于4℃、8 000 r/min离心收集菌体，200 mmol/L PBS（pH7.0）缓冲液清洗2次，PBS重悬后于冰上超声破碎，4℃、12 000 r/min离心10 min收集蛋白上清液，并以相同生长期未经H2O2处理的菌体蛋白作对照。蛋白浓度测定采用常规的Branford法。SOD活性的检测采用王爱国等[24]的方法，以抑制氮蓝四唑（NBT）光氧化还原50%的酶量为1个活力单位（U，U/mg·protein表示）；CAT活性的检测采用曾韶西等[25]的方法，以1 min内A240减少0.1的酶量为一个酶活单位（U）；POD活性的检测采用愈创木酚法[26]，以1 min每毫克蛋白质催化的470 nm下OD值变化0.01为一个酶活单位（U）。
2 结果 2.1 DrfE生物信息学分析用SMART在线软件进行功能结构域分析，结果显示DrfE蛋白在61-237氨基酸位置存在Ferritin类似的保守结构域（图 1-A）。运用BLASTP在线软件获得来源于不同物种与DrfE序列相似的蛋白，包括Deinococcus deserti、Chitinophaga pinensis、Verticillium alfalfae及Gramella forsetii，对其进行序列比对分析。结果（图 1-B）显示，DrfE蛋白与其他物种相似蛋白的序列一致性较低，但其在132、191和224位的谷氨酸Glu（E）非常保守；此外，His135、His227及Lys214位点也非常保守。根据已有研究推测，由这几个保守位点组成的蛋白亚基可能具有铁氧化酶（ferroxidase）的功能，能催化Fe2+转变成Fe3+[27]。
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| 图 1 DrfE蛋白结构域预测及序列比对 A：DrfE蛋白结构域预测；B：DrfE蛋白序列比对结果 |
回补菌株pdrfE∷Δ构建及验证如图 2所示，重组质粒Z3-pdrfE通过PCR、酶切及测序验证（图 2-A）。将测序正确的重组质粒转化突变株ΔdrfE，经含卡那霉素和氯霉素双抗性的TGY平板筛选，获得回补菌株pdrfE∷Δ，提取基因组进行PCR验证。结果（图 2-B）显示，以回补菌株pdrfE∷Δ基因组DNA为模板能扩增出1 314 bp的条带，而以突变株ΔdrfE基因组DNA为模板，没有扩增出条带，表明所获得的回补菌株pdrfE∷Δ完全正确。
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| 图 2 回补菌株pdrfE∷Δ的构建及验证 M：Trans2K Plus Ⅱ DNA marker；A：1：重组质粒Z3-pdrfE双酶切验证；B：2：以野生型基因组DNA为模板扩增结果；3：以回补株pdrfE∷Δ基因组DNA为模板PCR扩增结果；4：以突变株ΔdrfE基因组DNA为模板PCR扩增结果；5：以无菌水为模板的阴性对照 |
氧化和盐胁迫会造成细胞损伤，导致细胞死亡。本实验分别测定了野生型WT、突变株ΔdrfE和回补株pdrfE∷Δ在不同浓度H2O2冲击下的生长情况。结果（图 3）显示，正常培养条件下3种菌株的生存能力没有显著差异，60 mmol/L H2O2冲击30 min后，突变株ΔdrfE对H2O2的敏感性显著高于野生型WT和回补株pdrfE∷Δ，而80 mmol/L H2O2冲击30 min后，突变株ΔdrfE几乎不能生长。盐胁迫表型与氧化胁迫类似，4 mol/L NaCl处理4 h后，突变株ΔdrfE对盐的敏感性显著高于野生型WT和回补菌株pdrfE∷Δ，5 mol/L NaCl处理4 h后，突变株ΔdrfE对盐冲击更加敏感（图 3）。以上结果说明，drfE基因缺失导致耐辐射异常球菌对H2O2和NaCl敏感，并且drfE基因的回补能够恢复突变株在胁迫条件下的表型缺陷，表明DrfE蛋白在细胞抗氧化和耐盐过程中发挥重要作用。
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| 图 3 不同浓度H2O2和NaCl处理对野生型WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE::Δ菌株生长的影响 |
Fe是动植物和微生物生长发育必不可少的营养元素，低浓度的Fe在生物体正常的生理代谢中起着非常重要的作用，但高浓度的Fe对生物体的生长具有抑制和毒害作用。为了研究耐辐射异常球菌drfE基因的缺失对胞内Fe2+含量的影响，本实验测定了正常培养条件下野生型WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE∷Δ细胞内铁离子的含量。结果（图 4）显示，突变株ΔdrfE胞内Fe2+含量高于野生型菌株WT和回补菌株pdrfE∷Δ，说明drfE的缺失会导致耐辐射异常球菌细胞内Fe2+含量的增加，DrfE蛋白可能参与了耐辐射异常球菌体内铁代谢途径。
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| 图 4 野生型WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE∷Δ菌株胞内Fe2+的含量 |
抗氧化酶是耐辐射异常球菌抗氧化体系的重要成员，主要参与细胞体内的抗氧化反应。为了研究drfE缺失对抗氧化酶活性的影响，本研究分别测定了终浓度为60 mmol/L和80 mmol/L H2O2分别处理15和30 min条件下，野生型WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE∷Δ体内CAT、SOD和POD活性，并设置未经H2O2处理的菌株为对照。结果（图 5-A）显示，在未经H2O2处理条件下，突变株ΔdrfE的CAT和SOD活性低于野生型WT和回补菌株pdrfE∷Δ，60 mmol/L H2O2处理15 min后，突变株ΔdrfE的CAT和SOD活性显著低于野生型WT和回补菌株pdrfE∷Δ，经80 mmol/L H2O2处理15 min后，CAT和SOD活性下降更加明显。同样的，用浓度为60、80 mmol/L H2O2处理30 min后，突变株ΔdrfE的CAT和SOD活性显著低于野生型WT和回补菌株pdrfE∷Δ（图 5-B）。在正常培养条件和H2O2冲击条件下，野生型菌株WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE∷Δ体内POD活性均无显著变化（图 5）。由此得出，drfE基因的缺失会引起耐辐射异常球菌体内CAT、SOD等抗氧化酶活性的下降，从而影响耐辐射异常球菌清除ROS的能力，表明drfE基因能够通过影响耐辐射异常球菌体内抗氧化酶的活性，参与细胞体内的抗氧化反应。
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| 图 5 H2O2处理对野生型WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE∷Δ菌株体内抗氧化酶活性的影响 A：不同浓度H2O2处理15 min后野生型WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE∷Δ菌株体内CAT、SOD和POD活性的变化；B：不同浓度H2O2处理30 min后野生型WT、突变株ΔdrfE和回补菌株pdrfE∷Δ菌株体内CAT、SOD和POD活性的变化 |
生物体遭受非生物胁迫会产生大量的活性氧自由基，从而导致细胞内蛋白质、脂类、碳水化合物和DNA等严重损伤。细胞内CAT、SOD、POD等多种抗氧化酶在清除氧自由基系统中发挥主要作用，其中SOD是一种非常重要的抗氧化酶，能够催化O2·-转化为H2O2和O2[24, 28]，CAT和POD能够将H2O2转化为H2O，降低H2O2对细胞膜组分造成的氧化损伤[22]。氧化和高盐胁迫条件下，drfE的突变导致耐辐射异常球菌生存能力显著下降，可能是由于细胞内CAT、SOD、POD活性发生改变，造成细胞抗氧化系统紊乱所造成。据文献报道，不同的生物体对氧化胁迫的敏感性有很大的差异，抗氧化酶活性高的生物体，其抗氧化能力也能够维持在较高的水平[29-32]。
铁是生物体生长发育过程中所必需的矿质元素，但高浓度的Fe对生物体产生毒害作用，影响生物体的生长[7-10]。细胞内过量的Fe2+能与H2O2反应形成羟自由基（OH·），羟自由基是具有超强氧化能力的ROS，会对细胞造成氧化胁迫[1]。此外，生物体内Fe2+的含量过高可能会使细胞内CAT、SOD和POD等抗氧化酶类的活性受到不同程度的抑制。据报道，铁蛋白能催化Fe2+生成Fe3+并以水合氧化铁矿物质的形式储存铁，同时能够降低H2O2胁迫和过量Fe2+所产生的危害[16, 17]。生物信息学分析发现DrfE属于铁蛋白2超家族（Ferritin _2 superfamily），是一类铁蛋白。本研究结果表明，drfE的缺失造成耐辐射异常球菌体内铁离子含量的升高，并导致胁迫条件下细胞内CAT和SOD等抗氧化酶类活性的显著下降，致使耐辐射异常球菌抗氧化能力的下降。由此推断DrfE蛋白能够阻止Fenton反应产生具有超强活性的OH·，并且可能保护抗氧化酶使其保持较高的活性，从而保护细胞免受过量H2O2和体内铁代谢所引起的氧化损伤。drfE缺失会导致细胞内CAT、SOD活性显著下降，而对POD活性并无显著的影响。可能是由于SOD与O2·-反应所产生的H2O2主要被CAT利用，因此CAT和SOD这两种酶被大量消耗，故这两种酶活性下降，而POD较少参与到H2O2的清除反应中，故其POD变化不明显[33]。
本研究初步证实，耐辐射异常球菌中铁蛋白DrfE在调节细胞内Fe2+含量，增强CAT和SOD等抗氧化酶活性途径中发挥重要作用，从而保护细胞免受非生物胁迫产生的ROS的损伤，对Fe2+与抗氧化酶类之间的关系仍需深入研究。同时，耐辐射异常球菌所特有的类胡萝卜素是其有效的非酶类抗氧化剂，因此，DrfE蛋白可能参与类胡萝卜素合成途径，其作用机制有待于进一步研究。
4 结论耐辐射异常球菌drfE基因的缺失导致体内Fe2+浓度增加，同时导致过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活性的显著下降，从而使耐辐射异常球菌清除ROS的能力下降，使耐辐射异常球菌对过氧化氢和盐胁迫敏感。因此，DrfE蛋白增强了耐辐射异常球菌对非生物胁迫的抵抗能力。
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