随着人类生活质量的提高和健康意识逐渐加强，对能够抵御各种疾病的药物包括医用外源蛋白的需求逐渐加大，以中药医用蛋白为主的生物技术产业迅速发展。与其他原核表达系统相比，大肠杆菌因其遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、²H/¹³C/¹⁵N同位素标记技术稳定以及适用范围广等优点被广泛应用于外源蛋白表达研究。但原核细胞内糖基化和磷酸化作用缺乏，并且原核细胞质不是形成复杂二硫键的合适场所，导致外源蛋白在细菌细胞质中的表达尤为困难。针对近年来用于药用蛋白生产的大肠杆菌表达系统的不足，优化大肠杆菌表达外源蛋白从而增强其表达水平，提高生产效率，对于确定未来外源蛋白表达为主的生物技术的发展方向提供一定的理论依据。

近年来市售的大约30%的重组蛋白产品是由大肠杆菌生产^[1]。当蛋白分子量小于100 kD，翻译后修饰作用不影响特定结构和生物活性时，大肠杆菌表达系统是首要选择。本文对优化大肠杆菌表达外源蛋白的进展进行了分析，以期提高外源蛋白的表达水平提供理论依据。

1 研究现状 1.1 mRNA模板的优化

许多氨基酸由多种密码子编码，密码子在不同生物中使用频率不同。研究发现有些外源蛋白表达水平非常低，是由于稀有密码子在宿主细胞中的使用导致由稀有密码子编码的靶标基因转录延迟或提前终止，这时可根据宿主对密码子的偏爱性优化cDNA密码子，提高靶蛋白表达水平，并且互联网程序已开发出来协助密码子优化^[2]。另一种方法是采用能为目标基因提供稀有密码子且可共表达的大肠杆菌菌株，这些菌株已被Rosetta2和CodonPlus公司商业化。靶标基因及其周围基因的DNA序列需要进行检查，例如核糖体互补序列的结合序列“AGGAG”是否存在。

1.2 增溶标签

当外源蛋白在大肠杆菌中表达时，有些蛋白会在细胞质中形成不溶性的包涵体，这些包涵体颗粒直径50-500 nm不等^[3]，阻碍蛋白的表达，将靶蛋白融合在某些易于表达和纯化的“融合标签”的N末端或C末端可提高蛋白的高效可溶性表达。这种融合策略非常有效，常用的融合标签有：硫氧还蛋白（TRX），麦芽糖结合蛋白（MBP），谷胱甘肽-S-转移酶（GST），链球菌G蛋白B1结构域（GB1），小泛素相关修饰蛋白（SUMO）和HaloTag蛋白^[4-6]。MBP、GST和HaloTag也可以用作亲和标记物纯化蛋白，因为它们能以高亲和力结合特定的配体或树脂。当前的商业化标签pET32a（+）中含有trx A基因并携带用于蛋白生产和纯化的双融合伴侣^[7]。HaloTag在微量靶蛋白的纯化和蛋白质阵列平台的固定特别有用，因为它可以共价键结合到特定配体。

嵌合蛋白的结晶化和X射线晶体结构分析经常在没有去除亲和标记物或增溶标签时进行。靶蛋白的均匀性可以通过融合增溶标签改善，晶体的生长被包含增溶标签的化学单元促进，称为“载体驱动”效应^[8]。一些嵌合蛋白的核磁共振波谱分析已经做过，如果增溶标签不干扰目的蛋白的分析，可不去除可见的核磁共振增溶标签。例如，几种蛋白质的核磁共振波谱在没有消除GB1标签情况下成功地分析，作为核磁共振信号GB1标签很难引起信号退化^[4]，因为GB1的分子量较小，从GB1中衍生的核磁信号的数量也很少，最终核磁共振信号明确分配。但与GST融合的蛋白质，由于GST的一部分核磁信号被严重拓宽，从目的蛋白衍生的核磁信号可被检测^[9]。因此，在NMR检测中，基于目的蛋白特性、靶标蛋白分析目的和实验条件，目的蛋白的NMR分析应去除增溶标签^[10]。低耐热性和易聚集的目的蛋白在可溶性宿主细胞中与增溶标签融合表达时，虽然增溶标签可正确折叠，但目的蛋白部分未折叠，可去除增溶标签形成不溶聚合物^[11]，而NMR分析要求目的蛋白热力学稳定性和溶解性良好，所以这成了一个问题。在此情况下，NMR可利用²H/¹³C/¹⁵N同位素标记技术检测，未用同位素标记的“隐形增溶标签”融合到同位素富集的目的蛋白，从而由目的蛋白衍生的核磁信号被检测，而没有聚集^[12-14]。

细胞质在氧化还原分子调节下维持在高度还原环境中，外源蛋白的表达，需要形成复杂的二硫键并正确折叠，这往往导致包涵体的形成或蛋白质降解。大肠杆菌细胞周质间隙的还原环境低于细胞质，外源蛋白通过和细胞周质间信号序列（MBP、Dsba或Dsbc）的融合作用，从细胞质改变到细胞周质^[15]。

使用某些功能缺失的大肠杆菌突变菌株表征对硫氧还蛋白还原酶B（trxB）或谷胱甘肽还原酶（gor）的影响，如折叠酶系（如德国Novagen公司的origami试剂盒），是现行有效的一种替代方法。此外，Shuffle菌株可以共表达除功能缺失的trxB和gor外的目的蛋白重组二硫键异构酶（PDI），因为大肠杆菌中细胞质还原环境低下^[16]，Shuffle菌株的使用可能明显提高需要合成二硫键的外源蛋白的数量。DsbC与其他重组PDI的共表达可进一步促进目的蛋白质的折叠，减少聚合^[17]。

1.3 肽生产策略

多肽结构生物学分析在蛋白质间交互作用的竞争性抑制和用于治疗性药物的小分子中的应用是一个有价值的策略^[18]。尽管治疗性多肽本身可以作为药物直接使用，考虑到肽的安全稳定性和吸收效率，利用结构观察分析来提高其稳定性和开发小分子治疗药物具有重要意义。当目标肽上有疏水基或芳香氨基酸残基时，它与受体蛋白或脂质分子的结合具有重要的生物学意义，这时重组肽的过表达是存在疑问的。此外，由于肽链短，肽结构灵活多变，随着过表达有退化倾向。在这种情况下，使用类固醇异构酶（KSI）与肽串联融合体系，可作为pET31b（+）载体由Novagen商业化提供。编码目标肽的互补DNA盒式重复序列（3-6拷贝数），通过pET31b（+）质粒嵌入下游的KSI互补DNA。KSI多肽可以在大肠杆菌宿主细胞质中高度表达，形成包涵体，它将保护目标多肽免受蛋白酶的攻击，包涵体能水洗纯化，目标多肽可用先前程序进行纯化。包涵体的形成可避免细胞毒素对宿主的毒性作用。此外，甲硫氨酸残基被人为的编入连接肽中，通过溴化氰（CNBr）消化的一次性表达可以获得大量目标肽，显然这种方法不适用于本身具有甲硫氨酸残基的目标肽。另外高丝氨酸内脂能通过氢溴化物分解形成，并且位于目标肽的羧基端。

当目标肽以可溶的形式在大肠杆菌细胞质中时，泛素和GB1被用作增溶标签，溶解在靶标多肽N端的泛素标签能被泛素水解酶酶解，保留完整的目标肽，这是一个重要的突破点，因为如果增溶标签的酶切形成一个改良的多肽，这可能会影响三级结构的形成或生物功能，这种情形更可能引发多肽链变短，因此泛素标签和水解酶体系的使用影响短肽的过表达。重组泛素水解酶也能高度表达并且容易被大肠杆菌表达系统纯化。

MBP和Trx能被用作肽表达的增溶标签，MBP用PMAL载体系列可在细胞质或者细胞周质中过表达，该载体将周质转运信号置于MBP的N端。在靶标多肽本身是无序结构蛋白（诱导激酶翻译的cAMP联合蛋白）或者在靶标多肽逐渐消失的情况下，考虑到周质中含量较少的蛋白酶，包含胞质信号移位序列的MBP融合物可能降低靶标多肽的非特异性退化危险。

1.4 大肠杆菌表达系统改造蛋白产品的先进技术

pET表达系统是大肠杆菌细胞最常用的重组蛋白表达系统，由德国的Novagen公司商业上提供，不同的pET质粒DNA拥有T7启动子和目的基团，它们进入大肠杆菌宿主细胞进行外源基因表达。例如，源于λ噬菌体DE3的表达菌株BL21（DE3），带有lacUV基因启动子T7 RNA聚合酶编码基因。培养过程中，lacUV启动子的活性被lac抑制，这种抑制作用能通过异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）来消除，它可导致T7 RNA聚合酶的表达。然而，因为T7启动子的活性较强并且lac抑制剂对lacUV启动子的抑制作用较弱，pET系统在重组蛋白表达中可产生许多不合需要的结果：（1）大量的快速过表达外源蛋白容易形成包涵体，基于快速合成的异源蛋白和蛋白折叠的分子伴侣本身的缺点，它包含了不完全折叠的外源蛋白^[19]；（2）即使缺IPTG诱导，T7 RNA聚合酶的泄漏表达可能发生。因此，当靶标蛋白作为宿主细胞的细胞毒素时，转化株可能因为重组基因在宿主细胞中不稳定而难以获得，即使转化株能够获得，细胞生长和蛋白表达可能显著减少。

1.4.1 降低包涵体形成的一般策略

如果大量外源蛋白形成不可溶的聚集物，培养温度应降低到20-30℃或采取低营养物质，这些条件下基因的转录翻译被减弱，靶标蛋白可适当折叠，溶解性提高^[11]。当用BL21（DE3）表达菌株时，外源蛋白的表达水平和细胞内的堆积物能通过IPTG进行改变，当高频使用BL21（DE3）时，条件更难控制，目前这些菌株已经被Novagen公司商业化^[20]。另外，将少量的刺激性物质加入培养液中，例如能抑制大肠杆菌中蛋白合成的3%的乙醇或1 μg/mL的抗生素（卡那霉素、氯霉素、链霉素、四环素和嘌呤霉素），它可提高可溶性外源蛋白表达水平，因为分子伴侣本身的表达可能因刺激而减少。

pCold载体系统是一个先进的大肠杆菌表达系统，由日本TaKaRa公司提供，低温培养在大肠杆菌表达外源蛋白水平和增大可溶性方面成为最有效的手段之一。当培养温度迅速降低到15℃，CspA启动子与冷休克反应被激活，导致冷休克蛋白的特异性表达，并且CspA成为主要的冷休克蛋白产生。通过低温抗生素截短CspA的效应，大肠杆菌细胞生长停滞，蛋白质的从头合成被抑制。用这种方法，pCold载体的CspA启动子控制目的基因，低温条件培养大肠杆菌转化株，外源蛋白质可以特异性过表达。pCold载体系统可用于不含λDE3基因但能编码lacUV启动子序列和T7 RNA聚合酶的大肠杆菌宿主菌株，当使用pCold载体目的蛋白表达水平不足时，可猜想靶标mRNA的半衰期短和靶标蛋白降解。这时，靶标mRNA水平的降低通过使用BL21Star菌株作为宿主来预防，因为这种基因修饰的菌株NaseE活性比较弱。

1.4.2 抑制泄漏表达技术T7

RNA聚合酶表达的不完全抑制可导致细胞内cAMP增加，产生培养基中葡萄糖的消耗和后续除葡萄糖外的糖的新陈代谢。利用代谢物阻遏lacUV启动子，当用重组质粒转化大肠杆菌宿主细胞时，增加0.5%-1.0%（W/V）葡萄糖进入琼脂培养基中，T7 RNA聚合酶泄漏表达可被抑制，重组质粒的稳定性也得到改善；另一种方法是通过与T7溶菌酶共表达抑制T7 RNA聚合酶泄漏活性，T7溶菌酶是T7RNA聚合酶天然抑制剂。BL21 pLysS和pLysE菌株具有编码T7溶菌酶的质粒。另外，T7 RNA聚合酶基因由araBAD启动子控制时，T7 RNA聚合酶泄漏表达可以有效抑制，抑制的活性可通过添加L-阿拉伯糖激活，这样的菌株有来自Life公司的大肠杆菌BL21-AI。因此，一种特殊的大肠杆菌宿主菌株与葡萄糖诱导性代谢物阻遏剂的联合使用可有效表达目标蛋白。此外，保持重组质粒的低拷贝数是避免异源基因细胞毒性作用的一种有效手段，购自德国Novagen公司的pETcoco载体，每个细胞可以保持在1拷贝数，不像一般pET载体拷贝数通常为20-25个。

大多数的GPCR的天然表达水平比较低，在结构生物学研究领域建立实验方案来表达和纯化大量重组GPCR有重大意义^[21]，然而它的最佳表达条件难以确定，这是由于膜蛋白的低水平表达和大肠杆菌宿主细胞生物量的不充分，细菌和哺乳动物细胞之间存在的脂质膜结构和蛋白嵌入脂质双分子层机理不同是最大阻碍。横跨膜的、膜结合和高度疏水的蛋白质的溶解性、表达水平或外源蛋白的聚集，可以通过使用大肠杆菌宿主菌株如C41（DE3）、C43（DE3）或Lemo21（DE3）菌株得到改善^{[22, 23]}。C41（DE3）菌株是由BL21（DE3）通过基因修饰改造的。由于该菌株的lacUV启动子和其他成分的突变，T7 RNA聚合酶的表达水平相对较低，从而目的重组蛋白的表达率可显著降低。对于由未知因素引起的过表达和重组蛋白的聚集，C41（DE3）显示出很强应激作用。基于这些特点，重组膜蛋白或毒性蛋白的产率可以得到提高。C43（DE3）菌株是C41（DE3）衍生物，具有比C41（DE3）更高的胁迫耐受性。Lemo21（DE3）菌株具有独立的质粒pLemo，该质粒有rhaBAD启动子并随cDNA编码T7溶菌酶。与BL21（DE3）pLys菌株情况不同，T7溶菌酶的表达水平可通过调节L-鼠李糖的剂量控制，T7RNA聚合酶活性可以优化。作为C41（DE3）菌株类似物，可以缓解由外源蛋白的快速积累导致的应激，提高重组膜蛋白产量。此外，靶蛋白与Mistic的融合，是由110个氨基酸残基组成的高亲水性膜结合蛋白的枯草芽孢杆菌，是一种提高目标膜蛋白表达水平的策略。

1.5 pCold GST载体系统

当可溶性蛋白的表达水平低，即使使用pcold载体系统也不能提高时，可将pCold载体与增溶标签联合，这在增加可溶性外源蛋白的产量方面具有很好的意义。Hayashi和Kojima^[24]研发的pCold-GST载体，使得之前难表达或易聚集的外源蛋白在大肠杆菌成功表达。为了找到能使pCold系统作用最大化的增溶标签，Hayashi和Kojima尝试了许多增溶标签，包括MBP、GB1和Trx，最终发现与GST标签的融合效果最好。除了作为一种有效的增溶标签外，GST融合蛋白的GST部分核磁共振信号严重拓宽，因此目的蛋白衍生的核磁信号在没有消除GST标签的情况下被清楚的检测。目前，除了pCold-GST质粒外，pCold ProS2载体也已经应用，它能利用由ProS2衍生的S蛋白作为pCold系统进行外源蛋白表达的增溶标签^[25]。最近，一种²H/¹³C/¹⁵N同位素标记技术被报道，利用pCold ProS2系统和蛋白质结扎技术可将隐形的核磁共振ProS2多肽融合到可见的核磁共振目的蛋白^[26]。

1.6 单一蛋白生产技术

大肠杆菌体内本身存在毒素-抗毒素系统，它可适应环境的变化，在大肠杆菌的细胞生长和细胞程序性死亡起作用。MazF毒素蛋白具有mRNA干扰酶活性并且可选择性的降解mRNA中5' 端ACA序列的一部分。大肠杆菌中本身含有ACA序列，这些能被MazF消化，几乎完全抑制大肠杆菌中蛋白质的合成。在这种条件下，虽然大肠杆菌细胞生长在一个“准休眠状态”中，但细胞中ATP的合成和蛋白表达等基本生命活动可以继续，因为这些过程之前已经存在。在这一方法下，如果靶标基因中的ACA序列提前和其他碱基替换，靶标蛋白氨基酸序列仍然保持不变，异源靶标蛋白几乎完全表达。这个系统被Inouye及其同事研发，称为单一蛋白生产方法（SPP）。SPP有几个优点，特别是在²H/¹³C/¹⁵N同位素标记领域，同位素标记可选择性的结合蛋白，因此同位素标记技术的效率比传统标记技术高。即使在一定程度上核磁共振信号包含杂质，非靶标蛋白化学组衍生的核磁共振信号也实现了最小化^[27]，因此，单一蛋白生产系统在同位素富集膜蛋白产量方面尤其有效^{[28, 29]}，用大肠杆菌作为样品，同位素标记的膜蛋白在脂质膜中过表达的核磁信号能用固体核磁共振技术直接测得。最近一种新的单一蛋白质表达技术被发展，它利用了MazF-bs mRNA干扰酶，能够特异性的消化mRNA序列5' 端的UACAU碱基^[30]，目前SPP处在解决重组蛋白生产领域许多问题的边缘。

1.7 自诱导

当培养液中的细胞浓度近饱和时，外源蛋白表达在缺少IPTG情况下是自诱导的。自诱导能够通过以下方法完成：将单菌落接种于混合液体培养基（甘油、D葡萄糖和α乳糖作为大肠杆菌的碳源）并且培养20-24 h，D葡萄糖被耗尽之前乳糖的新陈代谢不能开始。葡萄糖被利用完后，乳糖的摄取开始，lac操纵子即可被诱导。诱导时间是重组蛋白表达的关键，可以通过改变培养基中的D葡萄糖的量调整。该方法有几个优点：培养过程简单；蛋白诱导具有较好的重现性；对于可能实现过表达的异源蛋白的筛选，蛋白诱导培养可同时进行。此外，该系统在NMR研究领域可对外源蛋白质进行²H/¹³C/¹⁵N同位素标记。该方法的缺点是外源蛋白质的非特异性降解可能性大，这可能是由于培养周期长。另外，竞争性诱导靶蛋白的表达可能会削弱细胞生长，当使用BL21（DE3）plys菌株过表达T7溶菌酶时效果可能会更显著。当外源蛋白有细胞毒性时，相比采用IPTG的传统诱导系统，生产大量的外源蛋白可能更加困难。先前的大规模培养，细胞的生长速度，目标蛋白的生产水平和最佳培养条件应通过初步试点规模培养来检查。

1.8 高细胞密度培养

在自诱导的情况下，细胞生长和蛋白表达可同时取得成效，较之IPTG人工诱导方法的生物量或外源蛋白的产量高。然而，大肠杆菌细胞的体力和代谢经济学活动受到限制，细胞生长速率与靶蛋白表达成反比，所以大的细胞量和靶蛋白的高表达水平很难同时获得^[11]。因此，在自诱导培养中，细胞量在诱导之前尽可能增加，在细胞密度趋于饱和时，预先调整培养基进行自诱导。高细胞密度培养和蛋白诱导表达适用于常规人工诱导系统。在这样的情况下，大量的大肠杆菌细胞在转化体通过大规模培养后重悬于小体积的新鲜培养基，通过加入诱导物到高细胞密度悬浮液，靶标蛋白实现诱导表达，大肠杆菌在活性最强的细胞指数期收集。Zou等^[31]通过控制诱导物的加入速率[0.4 g/（h ·L）]，采用分批补料方式发酵支链淀粉酶，得到菌体干重为15 g/L，Yang等^[32]采用分批补料方式发酵幽门螺杆菌多表位疫苗，且在诱导阶段使用甘油而非葡萄糖作为碳源，证明该种诱导方式不仅可以降低乙酸的积累，而且菌体得率可达70 g/L，目的蛋白占菌体总蛋白质的32%。Zhang等^[33]优化了链霉素Protein G高密度发酵中的溶氧、pH、初始接种量及发酵策略等因素，最终得到菌体干重为80-150 g/L，且目的蛋白产率最高为1 g/L。当使用²H/¹³C/¹⁵N同位素标记的外源蛋白的高细胞密度诱导技术时，同位素富集试剂的量可根据培养基的体积减少，这增加了同位素标记培养的成本，因为同位素富集的试剂非常昂贵。然而，实现高同位素掺入效率并不简单，使用的培养方法和最佳培养条件需要进一步分析研究。

1.9 流加培养

在诱导蛋白表达的过程中，通过连续添加新鲜培养基促进细胞生长和蛋白表达，这种技术被称为“流加培养”^[34]。在²H/¹³C/¹⁵N同位素标记培养采用普通培养基的情况下，流加培养技术显著提高了效率^{[35, 36]}。定期向培养基中加酸溶液、碱溶液和空气可以保持最佳的pH和通气量，这些因素对生物量和蛋白表达有重要影响。为了提高流加培养的效率，发酵罐的选择尤为重要。如果发酵系统不可用，使用通风效率较高的产量烧瓶比挡板三角瓶会更有效^[37]。如果使用挡板三角瓶，在振荡培养过程中采用蠕动泵不断输入空气或新鲜的养分进入培养基，也可以获得比较好的结果^[36]。一种升级版的流加培养技术最近被应用，称为EnBase技术。在这种方法中，封装在缓释聚合物凝胶中的葡萄糖在培养过程中缓慢而稳定的流入培养基中^[38]，这可能是EnBase技术与Miyazawa-Onami等^[36]方法的结合。细胞生理活动可以通过连续添加补料保持恒定，补料提供了营养并且稀释了分泌物，在培养过程中促进细胞生长及蛋白表达。近年来，一些先进的流加技术被开发，如浓缩补料批次培养（CFB）、膨胀床吸附（EBA）和灌注系统^[39]。在CFB法他和EBA法中，采用超滤膜或色谱树脂不断从培养基消除代谢废物，及时收集分泌的重组外源蛋白，这些技术能有效收集靶蛋白，尤其在产生微量或易降解的目标蛋白时非常有效。

2 展望

目前，大肠杆菌表达系统表达外源蛋白技术虽日臻成熟，但其表达效率还有一定提升空间，一些优化策略被采用，优化密码子、采用融合标签、单一蛋白生产技术、自诱导效应、高细胞密度培养以及流加培养等，旨在探索一种最优策略，降低包涵体形成，改善外源蛋白的表达水平，提高表达效率。另外，结构生物学的研究是必不可少的，表达系统可表达²H/¹³C/¹⁵N同位素或硒代蛋氨酸标记的重组蛋白。它不仅扩大蛋白质结构和生物学研究的多样性和可能性，也能在原子水平上分析许多以前难表达的蛋白质。细胞核磁共振分析是一个新的研究领域，需要蛋白表达系统和蛋白质同位素标记技术同步发展。随着细胞核磁共振技术的发展，活细胞中分子间相互作用或蛋白质结构测定的结构生物学分析逐渐实现^[40]。随着基因工程手段、同位素标记技术、核磁共振分析以及蛋白组学等研究方法对外源蛋白表达系统的不断改进，优化方案的不断改进，大肠杆菌表达外源蛋白的效率将会更进一步。