阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是一种持续性恶化的神经退行性疾病。近年来，AD的发病率及患病人数持续增长，已成为继心脏病、癌症、中风后的第四大致病性疾病。AD的病理变化主要表现为由Aβ在神经元细胞外形成的老年斑和由异常磷酸化tau蛋白在神经元细胞内形成的神经纤维缠结^[1]。Aβ是由其前体蛋白APP经β-和γ-分泌酶酶切产生的多肽片段^[2]，过量的Aβ累积后会发生聚集，形成寡聚体、原纤维和纤维等。其中，APP和Aβ单体在神经元和突触发育中起着重要作用^[3]，而Aβ寡聚体具有神经毒性，是AD发病的起始诱因。

抗Aβ免疫治疗是清除Aβ的有效途径，在AD治疗中具有广阔的应用前景。然而，自身免疫的风险、显著的副作用以及不确定的治疗效果限制了Aβ免疫治疗的发展^[4]。第一代疫苗AN1792利用全长的Aβ42多肽作为免疫原直接进行免疫治疗，在动物实验中表现出了良好的治疗效果，但是在临床Ⅱ期试验中由于引发严重的脑膜炎等副作用而被迫中止。随后的研究表明，全长Aβ含有的T细胞表位引发的T细胞活化及浸润是其副作用发生的主要原因^[5]。为了避免T细胞自身免疫反应，第二代Aβ疫苗ACC-001、CAD106等利用Aβ42的B细胞表位区作为抗原表位，同时搭载病毒载体蛋白提高了免疫效率，但是Ⅰ期或者Ⅱ期的临床试验发现其治疗效果仍不显著^[6-7]。同时，使用抗Aβ单克隆抗体的被动免疫治疗在AD临床试验中效果也不理想，例如bapineuzumab^[8]，solanezumab^[9]。这些单抗或者疫苗免疫产生的抗体可同时结合Aβ单体、寡聚体和纤维以及APP蛋白。这或许降低了有限的抗体靶向寡聚体的能力，再者，靶向具有正常生理功能的Aβ和APP可导致副作用发生。

2016年的一项Ⅰ期临床试验表明，一种特异性靶向Aβ寡聚体的单克隆抗体aducanumab，能显著降低AD患者脑内的Aβ水平，改善患者临床认知能力^[10]。除此之外，一项Ⅲ期临床实验表明，人静脉用免疫球蛋白(IVIG)可改善携带APOE-ε4基因的轻度到中度AD患者的认知损伤^[11]。我们认为IVIG中抗Aβ寡聚体的抗体组分是起到这一治疗作用的关键^[12]。这些研究表明，特异性针对Aβ寡聚体的免疫治疗对AD具有更好的治疗作用。

本研究选择Aβ42寡聚体作为阿尔茨海默病的免疫治疗靶标，利用本实验室从IVIG中纯化获得的抗Aβ42寡聚体特异性抗体组分(IVIG-AOB)筛选获得Aβ42寡聚体模拟表位，并克隆至HBc中制备VLP疫苗，然后免疫BalB/c小鼠，用ELISA方法检测小鼠血清中抗体水平，进一步验证这种新型疫苗Aβ42寡聚体模拟表位疫苗的免疫原性，期望获得一株较高免疫原性的疫苗。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验试剂

随机多肽噬菌体库(NEB公司，美国); BL21感受态细胞(TakaRa公司，日本); IVIG-AOB(实验室制备); 层析柱、亲和层析填料、疏水介质丁基及羟基磷灰石介质(GE公司，美国); 注射用铝佐剂、化学发光试剂盒(ECL)(Thermo公司，美国); Amyloid beta 42(Aβ₄₂)(American Pept-ide，美国); 二甲基亚砜(DMSO)、六氟异丙醇(HFIP)、十二烷基磺酸钠(SDS)、硫磺素T(ThT)、过硫酸铵(AP)、N，N，N，N，-四甲基乙二胺(TEMED)、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris、甘氨酸(glycin)、Tween-20(Sigma公司，美国); 200目碳支持膜、醋酸双氧铀(北京中镜科仪); 硝酸纤维素膜(NC膜)(Milipore公司，美国); HBc单克隆抗体(Invitrogen公司，美国); 抗His单克隆抗体、HRP-羊抗鼠(北京中杉生物工程有限公司); 96孔酶标板(广州JET公司); 可溶型单组分TMB显色底物(北京天根生化科技有限公司); 酸性显影粉、通用定影粉(天津世纪奥博公司); 其他试剂为国产分析纯。

1.1.2 实验动物

雌性Balb/c小鼠，4-6周龄，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 方法 1.2.1 Aβ42寡聚体模拟表位多肽的筛选

本试验采用固相结合法，将IVIG-AOB包被于聚乙烯平皿中，加入环形7肽噬菌体库，洗脱掉未结合或者结合不牢的噬菌体后收集特异性结合的噬菌体。在淘选过程中，使用逐步降低靶分子浓度(100 μg/mL，10 μg/mL，1 μg/mL)、提高去污剂Tween-20的浓度(0.1%、0.3%和0.5%)和增加洗涤次数(12次、15次和20次)的方法，以提高筛选效率。按这种方法进行了4轮的筛选，最终获得了特异性富集的噬菌体。

1.2.2 噬菌体阳性克隆的筛选

使用96孔ELISA板，每孔加入1 μg/100 µL Aβ寡聚体(PBS稀释)，同时需包被空白孔(PBS)以排除挑选的噬菌体与ELISA板结合，4℃包被过夜。包被结束后，用0.3% PBST洗脱3遍，除去残液并拍干后，每孔加满封阻液，37℃封闭2 h。封闭结束后，0.3% PBST洗脱两遍，除去残液并拍干。然后加入合适稀释度的扩增噬菌体贮液，室温震荡1 h，弃掉贮液并拍干，0.3% PBST洗脱10遍，然后用0.3% PBST以1：1 000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体，每孔加入100 μL稀释后的抗体，室温震荡作用1 h。用0.3% PBST洗板10次。每孔加100 μL TMB底物溶液，室温作用10 min，1 mol/L H₂SO₄每孔100 μL终止反应。用读板仪记录450 nm处的吸光值。

1.2.3 ELISA检测模拟表位多肽与IVIG-AOB结合活性

根据噬菌体ELISA检测结果及测序结果，合成了具有重复序列的6条环形7肽，在多肽合成时加入含有6个组氨酸的His标签(CxxxxxxxCHHHHHH)，以检测其与IVIG-AOB的结合情况。环形多肽ELISA检测时，包被样品为IVIG-AOB，每孔1 µg/100 µL，一抗为带His标签的多肽，二抗小鼠抗His标签的单抗，其余按1.2.2的方法。

1.2.4 HBc与模拟表位多肽重组蛋白的表达纯化

首先将表位多肽插入HBc149的免疫显性区域(Major immunodominant region，MIR)，重组的HBc表位嵌合基因克隆至pBR327质粒中。然后将质粒转化至BL21感受态细胞中，挑取单克隆后在含有氨苄抗生素的LB培养基中培养过夜，按照1:50接种至M9培养基，37℃诱导培养24 h。培养结束后，于8 500 r/min离心5 min，收集菌体，加入2 mL重悬buffer(50 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl)，加入蛋白酶抑制剂PMSF，混匀，超声破碎菌体，12 000 r/min离心10 min，分别取上清和沉淀; 利用SDS-PAGE鉴定蛋白表达。最后将菌体裂解上清进行硫酸铵沉淀(80%)粗纯后，利用疏水层析和羟基磷灰石进行两步纯化，收集洗脱液。

1.2.5 表位疫苗免疫

取4-6周龄的雌性BalB/c小鼠18只，分6组，每组3只，皮下免疫3次，每次间隔两周。接种剂量为每只小鼠100 μg HBc重组蛋白VLP抗原混合Imject^® Alum佐剂。抗原与佐剂的比例为3:1(V/V)。

1.2.6 ELISA检测小鼠血清中抗体水平

在第3次免疫后第10天，利用眼眶取血收集血清。在96孔板中分别包被用PBS稀释的表位多肽和Aβ42寡聚体(均为0.5 μg/100 μL)，血清利用封闭液按照1:100稀释，二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG，其他步骤同1.2.2。

1.2.7 统计学分析

所有实验数据均为平均值±标准误差。采用T-TEST分析各组样品间的显著性差异。P < 0.05被认为具有统计学差异。*表示P < 0.05，**表示P < 0.01，***表示P < 0.001。

2 结果 2.1 噬菌体多肽库的筛选

经过4轮的筛选，噬菌体的产出量由4.5×10⁶ CFU/mL提高到1.0×10⁹ CFU/mL，投入产出比从2.3×10^-5提高到5×10^-3，提高了200多倍。淘选条件及噬菌体富集变化，见表 1。

2.2 噬菌体阳性克隆的淘选

ELISA检测4轮淘选后获得的单克隆噬菌体，经OD₄₅₀的比值分析，IVIG-AOB/对照(阿达木单抗)大于1.7被认为阳性克隆。一般以样品组比上对照组大于2被认为阳性，为了获得更多的克隆数，在此以大于1.7作为选择参数。从288个克隆中挑出118株阳性克隆，并对其进行测序。结果表明，118株阳性克隆中共有6条序列具有两次及两次以上的重复，分别命名为C1-C6。

2.3 验证多肽与IVIG的结合情况

ELISA检测以上合成的6条多肽C1-C6，结果(图 1)表明，多肽C1与IVIG-AOB结合与对照组没有差异，说明C1可能与抗体的恒定区结合; 而C2-C6与IVIG-AOB的结合明显高于与对照抗体的结合，说明C2-C6这5条多肽是潜在的Aβ寡聚体模拟表位。

2.4 HBc重组蛋白构建、表达及纯化分析

SDS-PAGE和Western Blot检测表明HBc表位重组蛋白能够成功表达，Western Blot检测抗体是抗HBc抗体，目标条带在14-17 kD之间(图 2)，条带大小与预期相符。

2.5 HBc表位重组蛋白组装检测

透射电子显微镜(Transmission Electron Micros-cope，TEM)检测结果(图 3)表明，HBc表位重组蛋白组装成正常的VLP颗粒。

2.6 HBc-VLP模拟表位疫苗免疫后血清中抗体的水平

包被表位多肽的ELISA检测结果(图 4)表明，5种HBc表位疫苗免疫3次后都可诱发针对各自表位的抗体，表明HBc载体是一种有效的半抗原载体。包被Aβ42寡聚体的ELISA检测结果表明，由于HBc-VLP是一种分子量大于3 000 kD，结构复杂的大蛋白，能够免疫产生多种抗体; Aβ42寡聚体则是不同分子量Aβ的混合物，包含多种不同的构象表位，因此HBc-VLP免疫产生的抗体可能会和Aβ42寡聚体发生一些交叉反应，导致HBc产生的抗Aβ42寡聚体抗体水平偏高。然而HBc-C4诱导产生抗Aβ42寡聚体抗体明显高于HBc对照组，其余则与HBc对照组无显著差异(图 5)，表明C4多肽较好的模拟了Aβ42寡聚体表位。

3 讨论

阿尔茨海默症(AD)是一种持续性恶化的神经退变性疾病，常发生于65岁以上的老人，是最常见的一种老年痴呆疾病^[13-15]。随着世界人口老龄化的加剧，AD已成为最大的公共健康问题^[16]。针对Aβ的免疫治疗一直被认为是治疗AD的突破口。目前，Aβ疫苗和抗体先后经历过30多次临床试验，但尚无一种疫苗或抗体能够在Ⅲ期临床试验中表现出良好的改善认知作用^[15]。系统分析表明，目前临床所使用的疫苗或者抗体都是针对Aβ单体的N端、中间或者C端，而Aβ单体具有正常的生理功能。因此利用免疫反应中和Aβ单体可能会引起潜在的副作用。同时，对AD发病机制的研究表明，由Aβ单体聚集形成寡聚体是AD发病的核心诱发因素，由此引发一系列毒性级联反应^[17]。因此，特异性靶向Aβ寡聚体的免疫制剂可能具有较好的治疗效果，并能减少副作用产生。2016年，一例利用抗Aβ寡聚体的单克隆抗体Aducanumab治疗AD的临床实验表明，Aducanumab能够明显改善AD患者的认知损伤和病理学损伤^[10]。

本研究利用从IVIG中纯化获得的特异性结合Aβ42寡聚体的组分IVIG-AOB为靶抗体，通过随机多肽库淘选获得了一系列与之结合的表位多肽; 以HBc为载体构建出多个表位载体疫苗，并进行免疫检测从而成功筛选出一株可免疫产生Aβ寡聚体抗体模拟表位疫苗HBc-C4。IVIG-AOB作为一种Aβ寡聚体抗体，相较于目前商业化的Aβ寡聚体抗体A11和OC(均为兔源抗体)，其来源于正常人体，安全性更高并特异性结合Aβ42寡聚体。筛选获得表位多肽C4与Aβ42一级序列无任何同源性，且C4为环形的多肽，因此我们认为模拟表位C4免疫产生的抗体不应该与Aβ42单体结合，从而有效避免了自身免疫反应问题。

HBc-C4是一种完全模拟Aβ42寡聚体的表位疫苗，与目前已报道的Aβ聚集体疫苗-Affitope AD02，SDPM1，3A，pBri等相比具有明显的优势。AD02表位与Aβ单体有50%同源性，其产生的抗体虽不和Aβ单体及APP结合，但主要识别Aβ纤维而非寡聚体^[18]。SDPM1是一种可结合Aβ40聚集体的环形20肽，其免疫产生的抗体可结合Aβ聚集体而不能特异性针对寡聚体^[19]。3A是由8种氨基酸(T、Y、S、H、I、V、F和L)随机合成的20肽，3A本身并不能作为Aβ寡聚体表位，而是其聚集物可免疫产生抗Aβ前纤维状寡聚体的抗体^[20]。与3A相似，ABri多肽聚集后形成的聚合物-pABri免疫小鼠能诱发针对Aβ寡聚体的抗体反应^[21]。AD02、SDPM1、3A及ABri等Aβ聚集体疫苗都能够明显改善AD转基因小鼠的记忆和病理损伤。因此，我们认为HBc-C4具有治疗AD转基因小鼠的潜力。除此之外，病毒样颗粒(VLP)是一种呈递外源表位理想的载体^[12]，目前已有多种VLP疫苗应用于临床研究，包括乙肝病毒表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen，HBs)疫苗和人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)疫苗^[13]等。乙肝病毒核心抗原(Hepatitis B core antigen，HBc)作为抗原制备出的疫苗已得到十分广泛的临床应用，其安全性已经得到确认。因而，以HBc-VLP作为载体制备的表位疫苗在未来临床试验中安全性优越。

4 结论

本研究成功验证了应用新型Aβ42寡聚体模拟表位制备AD疫苗的可行性。通过噬菌体筛选技术，成功获得了一类Aβ42寡聚体模拟表位多肽，并将其克隆至HBc载体中，构建HBc-VLP表位疫苗，通过免疫后筛选获得一株可产生抗Aβ42寡聚体抗体的模拟表位疫苗株HBc-C4。