无细胞蛋白质合成系统（Cell-free protein synthesis，CFPS）是在细胞抽提物中补充底物和能源物质，通过加入外源mRNA或DNA为模板来人工合成蛋白质的体外研究系统^[1]。与体内（in vivo）蛋白质表达体系相比，无细胞系统突破了细胞的限制，具有反应时间短、蛋白质表达迅速、不易于被蛋白酶降解、可表达对细胞有毒性的蛋白质等诸多优点^[2]。无细胞系统中的粗裂解液中包括核糖体、翻译起始因子等翻译所需的基础因子，通过外源加入蛋白酶抑制剂、氨基酸、能量再生物质及底物等可实现短时间内表达目标蛋白质^[3]。无细胞系统的开发和研究进展为蛋白组学的研究及高通量药物筛选提供了便捷的手段^[1-3]。

目前，已被开发和利用的无细胞系统有原核和真核系统两种类型，以大肠杆菌为代表的原核无细胞系统被广泛应用多年，其优点在于成本相对低廉且蛋白质产量较高^[4]。20世纪中期，人类首次采用细胞裂解液或抽提物介导蛋白质的体外合成，随后，无细胞系统在破解遗传密码子的研究中发挥重要作用^[5]。近年来，真核生物无细胞系统发展迅速，具有代表性的有麦胚芽抽提物（Wheat germ extract，WGE）系统、兔网织红细胞裂解液（Rabbit reticulocyte lysate，RLL）以及昆虫细胞抽提物（Insect cell extract，ICE）^[6]，其中WGE系统和RLL系统已经商品化并广泛应用在科学研究中^[7]。由于WGE系统和RLL系统中不含胞内膜结构以及缺乏病毒复制过程所需的寄主蛋白质，所以植物病毒无法完成复制^[8]，故上述商品化的无细胞系统无法用来详细研究病毒复制的分子机理。因此，急需开发出新的同时支持植物RNA病毒翻译和复制的体外植物病毒研究系统。

BY-2 Lysate（BYL）系统是很好的研究植物病毒翻译复制的无细胞体外系统^[8]。本文首先介绍了BYL系统的开发和制备过程，并对该系统与其他几种无细胞研究体系特点进行了比较；其次，探讨了BYL系统在植物RNA病毒翻译和复制机理的研究以及在植物RNA干扰机理方面的研究进展；最后，对BYL系统在植物病毒学及分子生物学方面的应用前景进行展望，旨在希望更多的研究者系统的了解BYL无细胞系统。

1 BYL无细胞系统的开发

植物RNA病毒的细胞内复制过程包括：通过微伤口进入细胞内后脱去外壳，释放核酸RNA并劫持寄主翻译系统来进行复制蛋白质的表达。接下来，病毒核酸RNA被招募至对应的细胞内膜结构进行复制复合体的装配，并进行负义链RNA和正义链RNA的合成^[9]。在体内研究体系中，侵入细胞的病毒核酸经过翻译，负义链合成以及正义链合成的数次反复循环后才能检测到病毒的累积。在上述蛋白质翻译和核酸复制的循环中的任何过程出现问题，最终结果均导致无法检测到病毒的积累。早期对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）研究中，构建的TMV5' UTR碱基缺失突变体RNA无法在原生质体中进行自我复制，其结果说明5' UTR的序列对于TMV的复制重要，但无法明确该序列对于负义链合成或正义链合成中的哪一环节起关键作用^[10]。相比体内的研究体系，无细胞体外系统在RNA病毒的蛋白质表达和核酸复制机理的研究方面具有明显的优势，通过向体外系统中加入一种或多种外源RNA（mRNA、病毒RNA及人工RNA等），短时间内可迅速表达对应蛋白质，非常适合于核酸以及蛋白质的互作的相关研究。因此，无细胞体外系统可以将病毒的蛋白质表达、负义链RNA合成，以及正义链RNA合成的过程的机制进行独立研究，可很好的解决上述问题。

无细胞系统最早应用在动物病毒方面，通过海拉（HeLa）细胞抽提物的研究表明：脊髓灰质炎病毒（poliovirus）不仅可以在HeLa细胞抽提物中进行蛋白质表达，甚至可以进行复制及形成病毒粒子^[11-12]。通过HeLa细胞抽提物体外系统的研究发现，促使核糖体脱离翻译抑制剂嘌呤霉素（Puromycin）促进了poliovirus的负义链合成，抑制核糖体的移动的翻译抑制剂cycloheximide则极大的抑制了poliovirus的负义链合成却不对正义链合成产生影响，该研究通过体外系统首次揭示了poliovirus蛋白质翻译和核酸复制之间的转换关系^[13]。与动物细胞相比，植物细胞中存在占据很大体积的液泡结构，其内部为酸性并存在大量的RNA酶和蛋白酶。所以，在留有液泡植物细胞抽提物中，植物病毒会受到RNA酶和蛋白酶的攻击无法完成翻译和复制^[8]。综上，用于制备植物病毒体外裂解液的植物细胞需要具备以下特点：（1）从植物细胞容易获得原生质体、不易破碎；（2）可通过密度梯度离心法除去液泡；（3）植物细胞处于分裂期，翻译活性较高且支持较多种类病毒的增殖。

烟草BY-2（Bright yellow-2）细胞是分裂速度最快的植物悬浮细胞之一，其细胞数量在一周时间可繁殖到初始的60-80倍^[14]。BY-2悬浮细胞通过恒温恒定转速下通过MS培养基进行传代培养。由于其不受温室、土壤和光照等条件限制，具有操作简便，可重复性高等特点，除对植物病毒的研究外，还被广泛应用在植物生理、药剂筛选及重组蛋白质表等研究中^{[14, 15]}。BY-2细胞经过果胶酶（Pectinase）和离析酶（Macerozyme）处理后得到BY-2原生质体，根据液泡和细胞质密度的差别，采用细胞分离液Percoll通过密度梯度离心法^[16]将BY-2原生质体液泡部分分离出去得到微小原生质体（Mini protoplasts）。接下来，通过匀浆器将微小原生质体进行裂解，最终得到的裂解液称为（Evacuolated tobacco BY-2 protoplast lysate，BYL）^[8]。向BYL中添加能量基质、氨基酸以及核酸蛋白酶抑制剂后，RNA病毒可在该系统中进行蛋白质翻译及核酸复制，以BYL系统中加入的病毒核酸RNA为模板，无需经过数次病毒复制循环，便可在短时间内进行蛋白质翻译（1-2 h）和核酸负义链的合成（3-4 h）^{[8, 17-18]}。因此，将人工构建的病毒突变体RNA接种BYL系统，通过检测病毒蛋白质和RNA的积累量可明确在病毒蛋白质翻译以及复制过程中起作用的关键因子。

2 BYL无细胞系统在植物病毒研究中的应用

目前，采用BYL系统对番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）和红三叶草坏死花叶病毒（Red clover necrotic mosaic virus，RCNMV）的蛋白质翻译和核酸复制机理方面进行了较为深入的研究。BYL系统在开发出以后，首先应用在ToMV的翻译和复制机制的研究中^[8]，结果表明ToMV可以在BYL系统中表达130 kD和180 kD的复制蛋白质（p130和p180），ToMV可以通过系统中瞬时表达出的复制蛋白质进行负义链RNA和正义链RNA的合成^[8]。为了明确BYL系统中的膜结构在ToMV复制过程中的作用，通过高速离心除去BYL系统中的膜结构得到mdBYL（membrane-depleted BYL）^[19]，在mdBYL中ToMV的核酸RNA可以高效率的进行蛋白质表达，但无法进行核酸复制^[19]。接下来，通过puromycin中止翻译并加入膜组分（P30 BYL）后，可以显著的促进ToMV核酸的复制^[19]，该结果揭示了BYL系统中的膜结构对于ToMV的复制起到不可或缺的作用。上述实验的重要意义在于，在BYL体外系统中对膜的操作可将病毒翻译和复制两个过程巧妙的拆分开来进行独立研究。植物RNA病毒需形成复制复合体（Replication complex）来进行RNA的复制^[20]，但是ToMV复制复合体的形成机制在此前尚不清楚。研究表明，在mdBYL中ToMV的复制蛋白质p130在翻译未终止时可顺势结合到核酸RNA的5’端序列，形成的复合体命名为PMTC（Pre-membrane-targeting complex），在BYL系统中通过外源RNA反式表达的p130不能与ToMV核酸RNA相结合，上述研究揭示了PMTC极有可能与细胞内的膜结构相结合并促进复制复合体的形成^[19]。此外，BYL系统还被应用在ToMV抗病基因的研究中，研究表明番茄抗ToMV基因Tm-1中编码80 kD的蛋白质p80^GCR237可直接与野生型ToMV的p130相互作，同时突破Tm-1抗性的ToMV变异体LT1的p130不能与p80^GCR237发生互作^[21]。研究揭示野生型p130与p80^GCR237发生互作后会抑制复制复合体的形成^[21]。

RCNMV是双分节基因组的RNA病毒，基因组RNA1和RNA2分别采用顺势（in cis）和反式（in trans）招募复制蛋白质p27后进行核酸复制^[22]。与三分节RNA病毒的雀麦花叶病毒（Brome mosaic virus，BMV）不同的是，RCNMV的RNA1和RNA2的非翻译区域（UTR）序列相似度低，其RNA二级结构区别很大。通过BYL系统的研究明确了在RCNMV RNA1的3' UTR的TE-DR1茎环结构对于p27的翻译十分重要^[23]，而3' 末端的SLDE和SLF两个茎环结构对于RNA1的负义链合成起关键作用^[17]，上述研究明确了在RNA1的3' UTR所形成的多个RNA二级结构在病毒增殖过程中起到关键且不同的作用，对于其他RNA病毒的复制机制研究有很好的指导意义。RCNMV的RNA2编码运输蛋白质MP，通过BYL系统的研究表明，RNA2的3' UTR区域存在的Y字形RNA结构对于RNA2的负义链合成起到了重要作用^[18]。链霉素标签（Strepto-tag）法是研究RNA与蛋白质互作的重要方法^[24]，通过Strepto-tag的研究发现RCNMV RNA2的Y字形RNA结构对可以和复制蛋白质p27直接互作^[24]，上述研究通过BYL系统很好阐明了RCNMV的RNA2通过反式结合p27将其招募至3' 末端进行负义链RNA的合成^{[18, 24]}。除核酸复制以外，BYL系统也适合用于与病毒互作的寄主蛋白质的鉴定及功能方面的研究：通过Strepto-tag法的研究发现eIF4E和PABP与RCNMV RNA的互作对于RCNMV的翻译起到重要作用^[25]；RCNMV在BYL系统中表达复制蛋白质后可以与寄主蛋白质形成480kDa的复制蛋白复合体^[26]，研究还发现热休克蛋白70（HSP70）、热休克蛋白90（HSP90）及泛素（Ubiquitin）等多种重要的寄主蛋白质与RCNMV p27的相互作用对于复制蛋白复合体的形成起到重要作用^[26]。综上所述，采用BYL系统的研究初步明确了参与RCNMV的蛋白质表达及核酸复制的重要RNA二级结构的功能，以及与病毒核酸和蛋白质相互作的重要寄主蛋白质的功能。

除ToMV和RCNMV之外，BYL系统已被确认可支持TMV，BMV，芜菁皱缩病毒（Turnip crinkle virus，TCV），番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）等RNA病毒的体外翻译和核酸的复制^{[8, 17, 19, 27-28]}。对于其他的RNA病毒的研究也具有良好的应用前景。

3 其他植物病毒无细胞研究系统的对比

麦胚芽抽提物（WGE）系统开发始早于BYL系统，始于20世纪70年代^[29]，WGE系统广泛支持真核生物和原核生物mRNA的无细胞蛋白质翻译，其中含有蛋白质合成所必需的细胞组分（tRNA，核糖体，起始、延伸和终止因子）等，除去了大部分麦胚细胞内源RNA以降低背景的干扰^[30]。由于不含有胞内膜结构，植物RNA病毒在WGE系统中不能进行自我复制，但可以良好的进行蛋白质表达。研究人员通过WGE系统对大麦黄矮病毒（BYDV）不依赖帽（Cap independent）的翻译机理进行了深入研究。本文挑选列举以下研究结果：采用WGE系统的研究明确了BYDV的5' UTR和3' UTR的长距离互作对于病毒翻译起道重要作用^[31]；揭示了BYDV亚基因RNA2的核酸序列具有负调控病毒复制蛋白表达的作用^[33]；明确了BYDV核酸RNA与真核生物翻译起始因子eIF4F相互作用^[33]。除BYDV外，WGE系统在其他RNA病毒的研究中也有应用，如对马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）研究发现PLRV sgRNA1翻译调控因子存在于CP开放阅读框（ORF）中以及通读蛋白区域^[34]等。WGE系统应用在植物病毒研究方面的优势在于：WGE已经商品化可保证翻译活性，无需亲自制备。相对不足在于：WGE系统中不含有内质网等病毒复制所需要的细胞结构，无法用于病毒的复制机理的研究。

酵母无细胞抽提物（Cell-free extract，CFE）是将酵母菌株BY4741通过破碎后获得的体外病毒翻译复制系统^[35]，主要应用于TBSV的核酸复制以及重组相关机制的研究中。例如：基于酵母CFE系统的研究表明TBSV复制蛋白质的装配需要寄主HSP70（酵母蛋白质Ssa1/2p），新装配的复制蛋白复合体支持TBSV完整的核酸负义链和正义链的合成^[36]。除TBSV以外，酵母CFE可支持同为番茄从矮病毒属的Carnation Italian ring spot tombusvirus（CIRV）的复制，并揭示CIRV的复制场所为线粒体膜结构^[37]。酵母CFE用于研究植物病毒复制的优势在于：酵母全基因组测序已经完成，且可通过载体质粒外源表达目的蛋白质或敲出目的基因后的酵母制备无细胞体系，方便用于特定的病毒或寄主蛋白质的研究。相对不足之处：酵母并非植物病毒的天然寄主，在基因及蛋白质方面与寄主植物存在一定差异，需在相应的寄主植物中进行功能验证。

4 总结与展望

植物病毒学的研究技术在20世纪末开始发展迅速，得益于研究体系的快速发展。病毒属于活体专性寄生物，无法进行体外培养。长久以来对于植物病毒的翻译和复制机理的研究比较滞后。随着动物病毒研究技术的发展，近年来植物病毒的研究系统和技术也有了快速的进步。

除植物病毒方面的研究外，BYL系统还被应用在植物RNA干扰方面的研究中。由于缺乏合适的体外研究体系，人们对植物中的RNA诱导基因沉默复合体（RISC）的装配机制理解较少。近期的研究表明，在BYL系统中加入外源RNA表达拟南芥AGO1蛋白质后加入体外纯化的小干扰RNA（siRNA）或micro-RNA（miRNA），新形成的RISC可在BYL系统中特异性的切断目标核酸RNA^[38]。此外，通过BYL系统证明了寄主HSP90在RISC的形成过程中起到重要作用^[38]。研究表明BYL系统中通过外源RNA表达拟南芥AGO1后形成的AtAGO1-RISC可结合在目标RNA的ORF进而抑制了翻译的延伸（Translation elongation）的过程，阐明了植物siRNA（或miRNA）同动物小RNA一样具有抑制目标RNA蛋白质表达的作用^[39]。

随着精确基因编辑技术CRISPR/Cas9的发展及其在BY-2悬浮细胞中成功应用^[40]，通过敲除特定基因后BY-2细胞制备BYL系统成为了可能，经过基因修饰后的BYL在寄主蛋白参与植物病毒翻译/复制以及RNA干扰的机制研究方面会有良好的应用前景。同时，BYL系统可以作为高效率筛选抗病毒制剂的研究体系，为高特异性的病毒抑制剂的研制奠定重要的理论基础。