Raf激酶(Rapidly accelerated fibrosarcoma)是逆转录病毒致癌基因v-Raf的同源蛋白，它调控细胞的生长、分化、转化和凋亡等诸多生命过程，Raf-MEK-ERK通路是细胞信号传导的一条主干通路，这条通路的调控失常是细胞癌变的主要原因之一^[1-2]。

Raf激酶家族有3个成员A-Raf、B-Raf和C-Raf(Raf-1)，它们均可被上游信号分子Ras激酶激活(Ras突变和异常活化与20%的人类癌症相关^[3])，从细胞质转位到细胞膜，并通过磷酸化靶蛋白MEK来进一步激活ERK。但3个成员生物学功能却各有所不同^[4-5]。与B-Raf和C-Raf相比，A-Raf的激酶活性最低，仅为C-Raf的20%^[6]。而且，A-Raf突变在癌症中的发现相对较少，目前仅在肺癌细胞中发现了A-Raf-S214C突变体^[7]。

A-Raf-S214C突变体是A-Raf的第214位氨基酸丝氨酸突变为半胱氨酸。通过基因组学筛查在肺癌细胞中发现该突变体，并且它能转化支气管表皮细胞，使其发生癌变^[7]。在朗格汉氏增生症中也发现该突变^[8]。A-Raf(S214C)突变体对MAPK的激活能力几乎与B-Raf(V600E)相同^[8]。

本研究通过点突变法构建了A-Raf-S214C位点突变真核表达质粒，并在Flp-In T-Rex HEK293细胞进行稳转，构建该突变体的稳定表达细胞系，检测其在Flp-In T-Rex HEK293细胞中的表达水平，以及其对MAPK信号通路的作用。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞、菌株和质粒

A-Raf cDNA、Flp-In细胞、pcDNA5/FRET/TO载体由本实验室保存，感受态大肠杆菌DH5α购自TaKaRa公司。引物合成和测序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.1.2 主要试剂盒与抗体

TOYOBO点突变试剂盒购自东洋纺(上海)生物科技有限公司(该试剂盒含有KOD-Plus-、DpnI、T4 Polynucleotide Kinase、Ligation high等)；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自Tiangen公司；DMEM培养基、Blasticidin、Zeocin、Hygromycin、转染试剂Lipo-fectamine2000均购自Invitrogen corporation；胎牛血清和Opti-MEM培养基购自北京Solarbio有限公司；Anti-VSV、Anti-GAPDH、Anti-ERK、Anti-p-ERK购自Santa Cruz Biotechnology；辣根过氧化物标记鼠、羊、兔IgG抗体购自Kirkegaarg & laboratories公司。

1.2 方法 1.2.1 pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf质粒的构建

首先根据载体特点及VSV标签序列设计上下游引物(表 1)。然后用PCR的方法将VSV标签序列及限制性酶切位点引入A-Raf的cDNA，并用BamH I和Xho I酶对pcDNA5/FRET/TO载体和含有VSV标签和酶切位点的A-Raf cDNA进行双酶切，利用连接酶将扩增的VSV-A-Raf基因连接到pcDNA5/FRET/TO载体，从而得到pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf质粒(以下简称A-Raf质粒)。将质粒送生工生物工程(上海)有限公司测序。

1.2.2 设计点突变引物

以A-Raf质粒为模板，设计点突变引物(表 1)，并送生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.3 pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf-S214C突变体(以下简称A-Raf-S214C)的构建与鉴定

用TOYOBO点突变试剂盒构建突变体质粒。第一步，以A-Raf质粒为模板，用反向设计的两条引物对质粒进行完整的PCR。第二步，用Dpn I对模板质粒进行消化，37℃反应1 h。第三步，PCR产物自身环化：将Dpn I处理后PCR产物、灭菌蒸馏水、Ligation high、T4 Polynucleotide Kinase以2:7:5:1的体积比进行混合，混合物在16℃条件下反应1 h，实现PCR产物的自身环化。第四步，转化质粒：将自身环化后产物转化至DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板，37℃恒温培养12 h后，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，筛选阳性克隆，用质粒提取试剂盒抽提质粒，用Xho I和BamH I酶进行双酶切，并测序验证定点突变是否成功。

1.2.4 细胞培养及转染

Flp-In T-Rex HEK293细胞培养于含有10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的链霉素、3 μg/mL Blasticidin、100 μg/mL的Zeocin的DMEM维持培养基中，培养条件为37℃，5%CO₂和80%湿度。待细胞生长至密度为70%-80%时(T25培养瓶培养)，将构建成功的pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf-S214C质粒(以下简称A-Raf-S214C质粒)和pOG44质粒按1:9的比例共转染该细胞。具体步骤：将质粒DNA(0.3 μg)与pOG44(2.7 μg)混合物溶入500 μL Opti-MEM培养基中，并将6 μL脂质体Lipo-fectamine2000也溶入500 μLOpti-MEM培养基中，将二者混合均匀，静置15-20 min。在静置期间，将T25培养瓶中的培养基吸出，用1 mL 1×PBS洗涤3次，并加入2.5 mL Opti-MEM培养基，并放回培养箱继续培养。待静置结束后，轻轻将质粒与转染试剂混合物均匀混合，加入T25培养瓶中，混匀后放回37℃培养箱中继续培养。6 h后，将Opti-MEM培养基更换为正常维持培养基5 mL，继续培养。第2天，将转染了质粒的Flp-In T-Rex HEK293细胞传代至T125培养瓶中继续培养。第3天，将T125培养瓶中的维持培养基更换成含200 μg/mL Hygromycin的筛选培养基继续培养。之后每3-5 d更换一次筛选培养基，直至有单克隆细胞出现。然后将单克隆细胞用胰酶消化，转移至T25培养瓶，并更换为维持培养基继续扩大培养，用于后续试验。

1.2.5 免疫印记分析

将A-Raf野生型和A-Raf-S214C稳定表达细胞系铺6孔板，用浓度为0、1、5、10、100和1 000 ng/mL六个浓度梯度的Doxycycline(Dox)诱导VSV-A-Raf和VSV-A-Raf-S214C的表达，诱导24 h后裂解细胞，收集蛋白样品，并进行BCA定量，进行SDS-PAGE电泳、PVDF膜转膜、牛奶封闭、孵育一抗、1×TBST洗膜、孵育二抗、1×TBST洗膜、显影，用凝胶成像系统软件对结果进行分析。根据VSV的表达水平，可确定诱导剂的最佳浓度。再次将A-Raf野生型和A-Raf-S214C稳定细胞系铺6孔板，用之前检测得到的Dox最佳诱导浓度分别诱导细胞0、12、18和24 h后收集细胞，进行Western blot检测，方法同前，可确定Dox最佳诱导时间。

1.2.6 A-Raf-S214C突变体活性检测

将A-Raf野生型和A-Raf-S214C突变体稳定表达细胞系分别铺6孔板，每种细胞分成3组。待细胞生长至密度为70%-80%时，用最佳Dox诱导浓度分别诱导A-Raf野生型和A-Raf-S214C突变体稳定表达细胞。诱导12 h后，第1组细胞不做任何处理，将第2组和第3组细胞更换为无血清培养基，并继续用Dox诱导。再过12 h后，将第2组细胞用200 μL胎牛血清刺激5 min(加入血清后，培养基中血清终浓度为10%)，其余两组不作处理。然后进行细胞收样，用Western blot检测ERK的磷酸化水平，Western blot方法同前。

1.2.7 统计学分析

本实验数据处理应用SPASS21.0统计软件，采用t检验进行统计分析，显著性差异水平定位P < 0.05。

2 结果 2.1 pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf质粒的鉴定

将构建的A-Raf质粒用琼脂糖凝胶电泳分析，结果(图 1)显示，pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf质粒在相应位置具有清晰的条带，大小正确。质粒测序结果与NCBI数据库中基因序列完全一致，说明构建的A-Raf质粒符合实验要求。

2.2 pcDNA5/FRT/TO-VSV-A-Raf-S214C突变体质粒构建

通过反向PCR法对A-Raf进行点突变PCR产物经Dpn I酶切及产物自身环化后，将环化产物转染至DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定，其中12个代表性单克隆菌落的菌落PCR电泳结果如图 2-A所示。通过菌液PCR筛选阳性克隆，用质粒提取试剂盒抽提质粒，将其中前8个菌落的质粒分别进行Xho I和BamH I双酶切鉴定它们是否含有相应大小的插入片段，酶切的电泳结果如图 2-B所示。经序列比对，发现A-Raf序列第641位碱基C突变为G，即编码214位氨基酸的丝氨酸(TCC)突变为半胱氨酸(TGC)，即可确定点突变成功。测序结果如图 3所示。

2.3 免疫印记检测A-Raf-S214C突变体在Flp-In T-Rex HEK293细胞表达情况

用浓度为0、1、5、10、100和1 000 ng/mL Doxycycline分别处理稳定表达A-Raf及其突变体A-Raf-S214C的两个细胞系，处理24 h后，用抗VSV标签蛋白抗体检测A-Raf及其突变体A-Raf-S214C的表达情况，免疫印记结果(图 4-A)显示，100 ng/mL Dox是A-Raf及其突变体A-Raf-S214C的最佳诱导浓度。用该最佳浓度，再次分别诱导两个细胞系0、12、18和24 h，结果(图 4-B)显示诱导24 h后，A-Raf和A-Raf-S214C的表达量可达最大。本实验说明，用100 ng/mL Dox处理细胞24 h是诱导A-Raf和A-Raf-S214C表达的最佳条件。

2.4 A-Raf-S214C突变体对MAPK信号通路的影响

将A-Raf野生型和A-Raf-S214C稳定表达细胞系分别分为正常培养诱导组、饥饿组和饥饿后加血清刺激组进行实验，之后用Western blot检测ERK的磷酸化水平，发现饥饿组中的A-Raf-S214C突变体细胞的ERK磷酸化水平明显高于A-Raf野生型细胞(图 5-A)。重复3次该实验，并进行统计学分析，饥饿处理组A-Raf野生型和A-Raf-S214C突变体的ERK磷酸化水平，差异显著(**P < 0.01)，结果如图 5-B所示。该结果初步证明A-Raf-S214C突变体是A-Raf的激活突变体，与A-Raf相比，A-Raf-S214C对MAPK信号通路下游信号分子ERK的磷酸化能力更强。

3 讨论

Ras-Raf-MEK-ERK通路是细胞信号传导的一条主干通路，它调控着细胞的生长、分化、转化和凋亡等诸多生命过程^[9]。在这条通路中，Raf激酶作为关键组分之一发挥着重要作用^[6]。

Raf激酶是逆转录病毒致癌基因v-Raf的同源蛋白，Raf激酶家族有3个成员A-Raf、B-Raf和C-Raf(Raf-1)，3个成员结构相似(由调节区和激酶活性区两部分组成)，大小接近(A-Raf：606个氨基酸；B-Raf：806个氨基酸；C-Raf：648个氨基酸)，都可以被Raf激酶的结合蛋白Ras激活，之后从细胞质转位到细胞膜，并通过磷酸化靶蛋白MEK进一步激活ERK。但3个成员生物学功能和调控机制却各不相同^[10]。其中对B-Raf和C-Raf的研究最为深入，它们是Ras-Raf-MEK-ERK信号通路上的主要致癌蛋白也是激活MEK的主要蛋白^[10]。研究表明Ras-Raf-MEK-MAPK信号通路中的组分过表达或发生激活突变，与超过30%的人类肿瘤相关^[11]。其中Raf激酶的突变是导致细胞癌变的主要原因之一，如B-Raf突变与57%的神经系统癌变、39%的皮肤癌和38%胸腺癌相关^[12]；C-Raf突变与超过90%的小细胞肺癌相关^[13]。因此，调控Raf激酶也就成为了治疗癌症的最主要手段之一^[13-14]。

与B-Raf和C-Raf相比，A-Raf具有较低的激酶活性，其最大活性仅为C-Raf的20%^[15]，而且当前在肿瘤中发现A-Raf发生基因突变的报道较少。因此，人们对A-Raf激酶的关注较少，作为Raf激酶家族中重要一员，对其生物学功能仍不是非常清楚。这同时也给我们一种启示，为什么在进化过程中会形成一个较差的MEK激酶A-Raf，而与之同源的B-Raf和C-Raf会具有非常强的激酶活性？因此，这些问题驱使我们对A-Raf及其激活突变体进行研究。本研究发现，与野生型A-Raf相比，其突变体A-Raf-S214C可明显增强下游信号分子ERK的磷酸化程度，该突变体是A-Raf激酶的构建性激活突变体，可引起MAPK信号通路下游信号分子ERK异常活化。而异常活化的ERK可通过转录因子调控细胞周期进展、细胞分化、蛋白质合成、代谢、细胞存活^[16]、细胞迁移和入侵等使正常细胞获得许多肿瘤细胞的特征^[17]。也有报道称，A-Raf激酶在细胞凋亡^[18]、肿瘤形成^[19]、拮抗Raf激酶抑制剂^[20]等过程中扮演重要角色。因此，进一步了解A-Raf-S214C突变体的具体激活机制有助于帮助我们了解A-Raf的致癌机制，为人们寻找治疗癌症的方法提供了新的思路。

4 结论

利用点突变的方法，成功构建了A-Raf-S214C突变体质粒。并且成功构建了在Flp-In T-Rex HEK293细胞中稳定表达的A-Raf野生型和A-Raf-S214C突变体细胞系。在不同浓度的多西环素诱导下，A-Raf野生型细胞与A-Raf-S214C突变体细胞的表达量有所不同，二者均在100 ng/mL的多西环素诱导24 h的条件下，表达水平达最大值。与野生型相比，A-Raf-S214C突变体可明显增强MAPK信号通路中下游信号分子ERK的磷酸化水平，即A-Raf-S214C突变体是A-Raf激酶的激活突变体。