肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内占肿瘤发生的第六位，死亡率占第二位[1]。我国是肝癌的高发国，每年新发肝癌约46.6万例，占全世界新发病例的一半以上[2]。迄今尚未能完全明了HCC的发病机理，即使是根治性切除，5年内仍有60%-70%的病人出现转移复发，而局部治疗的转移复发率更高[3-4]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是一种硫酸乙酰肝素糖蛋白(Heparan sulfate proteoglycan，HSPG)，它通过糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl Phosphatidyl Inositol，GPI)锚定在细胞膜表面[5]。研究发现，GPC3在肝癌中特异性高表达，细胞膜上GPC3核心蛋白与Wnt结合，促进Wnts与其特异的Frizzled受体结合，进而促进细胞的恶性转化和肿瘤的持续增殖[6-8]。GPC3的肝素多聚糖链(HS)与肿瘤分泌的生长因子结合，抑制了生长因子的活性，从而抑制了肿瘤的生长[9-10]；缺少GPI锚定点的可溶性GPC3(GPC3△GPI，soluble Glypican-3，sGPC3)可阻断Wnts信号从而抑制Wnt依赖性肿瘤的生长[11]。GPC3与肝癌的发生、发展关系密切，但GPC3在高转移性肝癌中的作用仍需要进一步深入的研究[12-13]。本实验将sGPC3和GPC3基因分别转入高转移性肝癌细胞HCCLM3中表达重组蛋白，观察其对细胞生物学行为的影响，探讨GPC3与高转移性肝细胞癌发生、发展的关系，旨在为开发一种治疗高转移性肝癌的新型药物奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料pMD20-GPC3质粒和pcDNA3.0-GFP真核表达载体由本实验室构建；大肠杆菌E. coli DH5α本实验室保存；HCCLM3人肝癌细胞购自中国典型培养物保藏中心(武汉)。总RNA提取试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自Tiangen公司；胎牛血清、DMEM高糖培养基购自Gibco公司，限制性内切酶Xba I和EcoR I、T4 DNA Ligase、Taq DNA Polymerase、DNA Marker、第一链合成试剂盒购自Takara公司；蛋白质Marker购自Fermentas公司；anti-β-actin、anti-GPC3抗体购自Santa Cruz公司；LipofectamineTM3000购自Invitrogen公司。
1.2 方法 1.2.1 PCR扩增sGPC3和GPC3基因根据Gen-Bank上GPC3序列(NM_004484.3)和真核表达载体pcDNA3.0-GFP上多克隆位点设计3条特异性引物：P1：5'-CCGGAATTCATGGGGGGTTCTCATCACCACCATCACCATGCCGGGACCGTGCGCAC-3'；P2：5'-TGCTCTAGATTACTCGAGTGAACGTTCCCGAGGTTGT-3'；P3：5'-TGCTCTAGATTAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCACACCACCGAGAT-3'。(注：P1引物中的“GAATTC”为EcoR I酶切位点，；P2、P3引物中的“TCTAGA”为Xba I酶切位点)。
以测序正确的pMD20-GPC3质粒为模版，引物P1、P2扩增含大小1 680 bp无锚定结构的可溶性sGPC3基因序列；引物P1、P3扩增含大小1 740 bp的有锚定结构的全长GPC3基因序列。在sGPC3和GPC3序列两端分别引入限制性内切酶EcoR I和Xba I位点。引物由上海英潍捷基公司合成。
1.2.2 构建pcDNA3.0-GFP-sGPC3和pcDNA3.0-GFP-GPC3重组表达载体限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切PCR扩增的sGPC3、GPC3基因产物，经琼脂糖凝胶电泳分离和DNA纯化回收获得的目的基因sGPC3、GPC3，分别连接到经相应内切酶酶切的真核表达载体pcDNA3.0-GFP上，构建重组表达载体pcDNA3.0-GFP-sGPC3、pcDNA3.0-GFP-GPC3，并转化到DH5α感受态中，经抗生素筛选、酶切鉴定后送去测序。
1.2.3 细胞转染及RT-PCR和Western blot鉴定将对数生长期的HCCLM3细胞以5×105/孔接种于6孔板培养，待细胞长至饱和度70%-80%，Lipofecta-mineTM3000介导pcDNA3.0-GFP-sGPC3和pcDNA3.0-GFP-GPC3转染HCCLM3细胞(具体步骤参阅产品说明书)，设pcDNA3.0-GFP空载体对照。转染后72 h收集细胞，Trizol法提取总RNA，并逆转录合成cDNA，定量后以其为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。转染后96 h收集细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定样品的蛋白质含量，SDS-PAGE，转膜，用Anti-GPC3抗体检测GPC3的表达情况，β-actin作内参。以未转染的野生型细胞株为对照。IPP6.0统计目的条带的IOD值。
1.2.4 CCK-8法检测GPC3对HCCLM3增殖的影响以转染pcDNA3.0-GFP-sGPC3、pcDNA3.0-GFP-GPC3和pcDNA3.0-GFP后48 h的HCCLM3细胞为实验组，野生型HCCLM3细胞为空白对照组。取各组细胞接种于96孔板，5×103 cell/孔，每组6个复孔，在细胞贴壁后0、24和36 h，分别加入CCK-8测定波长450 nm的吸光度值(A450)。绘制各组细胞生长曲线并计算抑制率。
分组同1.2.4。取吹打成单个的各组细胞，作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每孔100个细胞均匀接种于12孔板中。置37℃、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养，当出现肉眼可见的克隆时，终止培养。用PBS小心浸洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，GIMSA染色液染20 min。计数大于10个细胞的克隆数，计算克隆形成率。
分组同1.2.4。细胞划痕：取各组细胞接种于24孔板中，1×105 cell/孔，待贴壁铺满后，用枪头垂直划痕，不能倾斜。用PBS洗去除划下的细胞，加入无血清培养基，37℃ 5% CO2培养。在0、24、48和72 h拍照观察细胞迁移的情况。Transwell实验：取各组细胞，在Transwell上室内分别加入200 μL无血清培养液配制成5×105个/mL的细胞悬液，下室加600 μL含10% FBS培养液，培养48 h。取出小室弃除上室液体，4%多聚甲醛固定5 min，用棉签擦尽上室未穿膜的细胞，DAPI染色，200倍光境下拍照，IPP6.0统计迁移细胞数。
1.2.7 流式细胞术检测GPC3对HCCLM3周期、凋亡的影响分组同1.2.4。PI单染检测细胞周期：收集各组细胞(＞l×106)于70%乙醇中-20℃固定24 h以上，收集固定后的细胞，加入RNA酶(终浓度100 μg/mL)，37℃水浴30 min，加入PI(终浓度50 μg/mL)染色，室温下避光15 min，流式细胞仪检测，用ModFit软件分析细胞周期分布。Annexin-V-FITC/PI双染检测细胞凋亡：不含EDTA的胰酶消化并收集各组细胞于流式管中，2 mL冷PBS洗涤后重悬于100 μL Binding Buffer，细胞密度约(0.25-1×107)cell/mL，分别加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混匀，避光室温反应15 min，加入400 μL Binding Buffer，流式细胞仪检测，FlowJo分析细胞凋亡比例。
1.2.8 统计学分析采用SPSS 16. 0统计学软件，计量资料用x±s表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 PCR扩增sGPC3、GPC3基因以测序正确的pMD20-GPC3质粒为模板，分别以P1、P2和P1、P3为引物，PCR扩增含有EcoR I和Xba I限制性内切酶位点大小约为1 740 bp的全长GPC3基因序列和大小约为1 680 bp的可溶性sGPC3基因序列。琼脂糖凝胶电泳结果如图 1所示，在1.6-1.8 kb之间，有清晰的特异性目的条带，大小与理论值相符。
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| 图 1 PCR扩增sGPC3、GPC3基因电泳图 M：200bp DNA Ladder；1-4：P1、P2为引物扩增的sGPC3基因片段；5-8：P1、P3为引物扩增的GPC3基因片段 |
EcoR I和Xba I双酶切鉴定，得到2个片段(图 2)，在1.6-1.8 kb之间的sGPC3或GPC3基因，在4.0-7.0 kb之间的pCDNA3.0-GFP载体片段，酶切结果与预期相符。测序结果与GenBank比较分析，目的基因无突变，pCDNA3.0-GFP-sGPC3和pCDNA3.0-GFP-GPC3重组表达载体构建成功。
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| 图 2 重组表达载体酶切鉴定图 M1：200 bp DNA Ladder；M2：DL10000 DNA Marker；1-3：pCDNA3.0-GFP-sGPC3质粒、EcoR I单酶切、EcoR I和Xba I双酶切；4-6：pCDNA3.0-GFP-GPC3质粒、EcoR I单酶切、EcoR I和Xba I双酶切 |
提取的总RNA用核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳检测，OD260/OD280≈1.95，有清晰的3条带(图 3-A)，说明RNA纯度较高，完整性良好，可用于后续的RT-PCR。利用GPC3特异性引物RT-PCR，以GAPDH基因为内参，结果(图 3-B)显示，与转染空载细胞和野生型细胞相比，转染含sGPC3和GPC3重组质粒后的HCCLM3细胞，GPC3 mRNA含量显著增加(P < 0.05)。
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| 图 3 细胞总RNA(A)和RT-PCR(B)电泳图 1：转染pcDNA3.0-GFP-sGPC3 HCCLM3细胞；2：转染pcDNA3.0-GFP-GPC3 HCCLM3细胞；3：转染pcDNA3.0-GFP HCCLM3细胞；4：野生型HCCLM3细胞 |
Western blot结果(图 4)显示，在约66 kD处有一个特异性条带。与转染空载细胞和野生型HCCLM3细胞相比，转染pcDNA3.0-GFP-sGPC3和pcDNA3.0-GFP-GPC3的HCCLM3细胞，GPC3/β-act-in蛋白条带IOD比值显著提高，说明sGPC3和GP-C3已在细胞中成功过表达。
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| 图 4 Western Blot结果图(A)和Western blot条带IOD比值统计图(B) |
CCK-8法检测结果(图 5)显示，在24和36 h，过表达sGPC3和GPC3与转染空载细胞和野生型HCCLM3细胞相比，细胞增殖均明显受到抑制，其中过表达sGPC3对HCCLM3细胞的增殖抑制率较过表达GPC3的显著增高，具有统计学意义[(44.53±1.46% vs 25.58±1.87%)、(33.84±1.14)vs(20.52±1.87)%，均P < 0.05]。
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| 图 5 CCK8法检测各组细胞的增殖情况(n=3，x±s，*P < 0.05 vs空载体) |
克隆形成实验结果(图 6)显示，过表达sGPC3和GPC3与转染空载体细胞和野生型HCCLM3细胞相比，细胞克隆形成率均明显降低[(20±3)%、(24±4)% vs(31±5.5)%、(34±6.5)%，P < 0.05]。结果表明，GPC3不仅抑制HCCLM3细胞的增殖，而且也影响其克隆形成能力，同时sGPC3更好地抑制细胞克隆形成。
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| 图 6 各组细胞的单克隆形成情况 A：细胞克隆形成GIMSA染色结果；B：细胞克隆形成能力的统计(n=3，x±s，*P < 0.05 vs空载体) |
由细胞划痕法建立细胞迁移模型结果(图 7-A)可知，在划痕后48和96 h，转染sGPC3细胞比转染空载体和空白细胞愈合速度慢；而转染GPC3细胞比转染空载体的愈合速度慢。可初步推断，过表达sGPC3和GPC3可抑制HCCLM3高转移性肝癌细胞的迁移。为了更准确的评价过表达sGPC3和GPC3对HCCLM3细胞迁移的影响，进行Transwell实验，结果表明：与转染空载体细胞相比，转染sGPC3和GPC3细胞迁移到下腔的数量明显减少(图 7-B)，转染sGPC3和GPC3迁移细胞数与转染空载体细胞相比，迁移率分别降低了36.04±2.30%和26.06±1.29%(图 7-C)。结果表明过表达sGPC3和GPC3能够抑制HCCLM3的迁移(P < 0.05)。
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| 图 7 各组细胞迁移情况的比较 A：细胞划痕检测各组细胞的迁移情况；B：Transwell检测各组细胞的迁移情况；C：B结果中迁移细胞数的统计分析(n=3，x±s，*P < 0.05 vs空载体) |
流式细胞术检测细胞周期结果(图 8-A)显示：转染空载体细胞和野生型HCCLM3细胞的G1期细胞所占比例分别为(42.53±0.43)%和(45.97±2.20)%，转染sGPC3和GPC3的细胞G1期所占比例分别为(68.22±4.36)%和(62.75±5.35)%，转染sGPC3和GPC3的肝癌细胞G1期细胞数均明显高于转染空载体和野生型HCCLM3细胞(P < 0.05)，说明过表达sGPC3和GPC3都发生了G1期阻滞。
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| 图 8 流式细胞仪检测各组细胞的周期分布 A：各组细胞的周期分布；B：各组细胞的各期分布统计(n=3，x±s，*P < 0.05 vs空载体) |
流式细胞术检测细胞凋亡结果(图 9)显示：转染空载体细胞和野生型HCCLM3细胞的凋亡率分别为(12.67±1.37)%和(11.98±1.66)%，转染sGPC3和GPC3的细胞凋亡率分别为(24.66±2.35)%和(17.99±1.82)%，转染sGPC3和GPC3均可促进HCCLM3高转移性肝癌细胞的细胞凋亡，其中转染sGPC3组的细胞凋亡率与转染GPC3比较，差异均有统计学意义(P < 0.05)。说明过表达sGPC3能更好的促进HCCLM3的凋亡。
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| 图 9 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡 A：各组细胞的凋亡情况；B：各组细胞的凋亡比例统计(n=3，x±s，*P < 0.05 vs空载体) |
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)基因包括1 740 bp的开放阅读框，编码具有580个氨基酸、大小为66 kD的蛋白。该蛋白核心由40 kD长的N端和30 kD大小的C端两部分组成，在C端有两个乙酰肝素多聚糖链(HS)。该蛋白在C端通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)结合在细胞表面，在被转运至内质网之后，GPC3 N端(SS：1-24位氨基酸)和C端的的引导肽(S560)被切除，后者被磷脂酰肌醇替代，成为蛋白在细胞膜表面的锚定点。GPC3在肝癌组织中特异性高表达，与肝癌的发生、发展关系密切。上调GPC3的表达可阻断FGF2介导的信号通路，抑制肝癌细胞的增殖；另外，GPC3下调了纤连蛋白和I型胶原的表达，从而抑制肝癌细胞迁移和侵袭[14-15]。反义RNA阻断HepG2和Hep3B肝癌细胞内源性GPC3的表达，减少G1期细胞阻滞，促进肝癌细胞的生长[16]。表达缺乏GPI锚定位的GPC3(GPC3△GPI，sGPC3)可阻断Wnts信号，而抑制Wnt依赖性肝癌细胞的生长，促进细胞凋亡[11]。本研究以测序正确的pMD20-GPC3质粒为模版，PCR法获得大小1 680 bp无锚定结构的可溶性sGPC3(GPC3△GPI，M1-H559)基因序列和大小1 740 bp的有锚定结构的全长GPC3基因序列，并克隆到真核表达载体pcDNA3.0-GFP中，成功构建pCDNA3.0-GFP-sGPC3和pCDNA3.0-GFP-GPC3重组表达载体，经脂质体介导转染高转移性肝癌细胞HCCLM3后，过表达sGPC3/GPC3抑制HCCLM3肝癌细胞的增殖能力和克隆形成能力，迁移率显著下降，周期阻滞于G1期，细胞凋亡率增加。本研究结果与上述文献报道的一致。
另有研究表明，没有糖胺聚糖的GPC3核心蛋白能与Wnts结合形成复合物，或与Frizzled结合激活经典Wnt信号途径促进肝癌组织生长[6, 17]。GPC3蛋白通过N末端脯氨酸丰富区和IGF2和IGFIR结合，减少了IGFLR和下游信号分子ERK的磷酸化，刺激肝癌生长[7-8]；另外，GPC3被siRNA干扰后或被GPC3 micorRNA和GPC3抗体靶向抑制后，不能激活经典Wnt信号途径，肝癌细胞的繁殖受到抑制[18-22]。本研究比较了过表达可溶性GPC3和能够锚定于细胞膜上的全长GPC3对HCCLM3肝癌细胞生物学行为的影响，结果发现，过表达可溶性GPC3对HCCLM3肝癌细胞的增殖能力和克隆形成能力的抑制作用明显强于全长GPC3；对HCCLM3肝癌细胞迁移、周期和凋亡的影响也具有显著性差异。上述研究提示GPC3在肝癌生物学行为作用中的复杂性，推测GPC3在肝细胞癌中的作用可能是多因素、多途径和多机制的，这可能与不同肿瘤细胞病理类型、表达GPC的水平有关。
4 结论本研究成功构建pCDNA3.0-GFP-sGPC3和pCDNA3.0-GFP-GPC3真核表达载体，并转染入高转移性肝癌细胞HCCLM3中，过表达sGPC3/GPC3均明显抑制细胞的增殖、克隆形成及迁移能力；同时sGPC3对细胞的抑制作用明显强于GPC3。
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