2. 江苏天江药业有限公司，江阴 214400
2. Tianjiang Pharmaceutical Industry of Jiangsu Province, Jiangyin 214400
纤维素酶在生物乙醇的生产过程中具有重要作用。但纤维素酶生产成本较高，在一定程度上限制了生物能源行业的发展[1]。目前，工业上常采用液体发酵法生产纤维素酶，其中原材料就占到了生产成本的40%-60%[2]。可见控制原材料的成本可以有效地降低纤维素酶的生产成本。此外，工业上还通过筛选高产菌株来控制生产成本[3]。
我国每年大概产生3 000万t左右的中药药渣。中药药渣的大量排放，已经对环境造成了严重的破坏，同时也严重制约了中药产业的发展[4]。目前，药渣过剩的问题已经引起了越来越多的关注。特别是利用生物发酵技术对药渣进行再利用研究，已经成为目前的研究热点。如敖杨等[5]利用生物发酵将金莲花药渣转化为饲料添加剂，其可以显著改善肉鸡的生产性能。黄凡等[6]利用黑曲霉固态发酵三七药渣生产纤维素酶。
甘草是临床上常用药，每年仅其制剂及提取物的消耗量就达近万吨，也因此产生了大量的废弃甘草药渣[7]。研究发现，甘草药渣不仅可以作为提取药用活性成分的原料，还可以作为廉价的生物质资源。甘草药渣中除含有丰富药用活性成分外[8-9]，其纤维素、半纤维素及木质素的含量分别达到17.4%、16.95%和9.54%[10]。近年来，关于甘草药渣的研究主要是对其生物活性物质的再利用研究，如张娟等[11]利用甘草药渣制备甘草查尔酮A; 方诗琪等[7]从甘草药渣中分离出具有抗氧化活性的物质。但甘草药渣在提取有效成分以后，其残余的固体物质仍会对环境造成污染。由此可见，仅利用甘草药渣的有效成分，仍不能有效的处置甘草药渣。因此，需要对甘草药渣中的有效成分和纤维素资源进行综合利用，尤其是纤维素资源的再利用研究。本实验的主要目的是筛选能够有效降解甘草药渣的菌株，确定菌株的最佳产酶工艺，同时研究该酶对甘草药渣的降解效率，以及酶解后药渣中药用活性成分提取率的变化。旨在合理处置甘草药渣，同时生产成本低廉、性能良好的纤维素酶。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株草酸青霉G2由本实验室从腐烂的甘草植株(甘肃定西)中分离得到。
1.1.2 甘草药渣甘草药渣由江阴天江药业提供，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为乌拉尔甘草药渣。甘草药渣经自然风干、烘干、粉碎、过60目筛后，置于干燥器中备用。
1.1.3 培养基选择培养基:(NH4)2SO4 3 g/L、尿素0.3 g/L、KH2PO4 2 g/L、甘草药渣50 g/L、MgSO4 0.5 g/L; CMC-Na平板:(NH4)2SO4 3 g/L、尿素0.3 g/L、KH2PO4 2 g/L、MgSO4 0.5 g/L、CMC-Na 10 g/L、琼脂15 g/L; PDA培养基:土豆200 g/L、葡萄糖10 g/L、琼脂15 g/L; 种子培养基:酵母膏1 g/L、葡萄糖1 g/L、(NH4)2SO4 3 g/L、尿素0.3 g/L、KH2PO4 2 g/L; 初始发酵培养基:甘草药渣、(NH4)2SO4 3 g/L、尿素0.3 g/L、KH2PO4 2 g/L、MgSO4 0.5 g/L、0.1%金属离子(FeSO4·7H2O 0.005 g/L、MnSO4·H2O 0.001 6 g/L、ZnSO4·7H2O 0.001 4 g/L、CoCl2 0.002 g/L)、0.1%吐温-80。
1.2 方法 1.2.1 菌株的筛选与鉴定菌株筛选:取腐烂的甘草或土壤1 g。将其分别置于以药渣为唯一碳源的选择培养基上进行富集，30℃、培养48 h。再将培养液适当的稀释，并涂抹到CMC-Na平板上，30℃、培养72 h。刚果红染色，挑选透明圈较明显的菌落置于PDA平板上进行纯化。同时，对纯化后的菌株进行液体发酵复筛。菌株的鉴定:对复筛后的菌株，进行形态学观察，同时外出送样进行测序。
1.2.2 培养方法斜面培养:将菌株划线接种于PDA斜面，30℃培养48 h。种子培养:每支斜面加5 mL无菌水，取1 mL接入种子培养基中，转速180 r/min，30℃、培养24 h。发酵培养:250 mL三角瓶中装入发酵培养基80 mL，按5%接种量接入种子培养液，转速180 r/min摇床培养。
1.2.3 酶活测定发酵液经4 000 r/min离心30 min，收集上清液即为粗酶液。参照文献[12]，粗酶液经适当稀释后，采用DNS比色法，测定滤纸酶、内切酶活力。参照文献[13]，粗酶液经适当稀释后，测定β-葡萄糖苷酶活。(1 mL酶液在pH4.8、50℃恒温水浴条件下水解底物，1 min内生成1 μmol葡萄糖定义为一个酶活单位，用U/mL表示。)
1.2.4 草酸青霉G2产酶条件分析分别考察药渣含量、初始pH、发酵温度、发酵时间、原材料预处理方式等因素对草酸青霉G2液体发酵的影响，并测量各发酵液的纤维素酶活力。
1.2.4.1 药渣含量对酶活的影响在初始发酵培养基中分别添加1%、3%、5%、7%、9%、11%的甘草药渣，其它条件不变，30℃、自然pH发酵120 h。
1.2.4.2 初始pH对酶活的影响在单因素实验1.2.4.1的结果下，将发酵培养基的pH分别调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，30℃发酵120 h，测量各发酵液的纤维素酶活性。
1.2.4.3 发酵温度对酶活的影响在单因素实验1.2.4.1和1.2.4.2的结果下，发酵温度分别为20、25、30、35、40℃的条件下培养120 h，测量各发酵液的纤维素酶活性。
1.2.4.4 发酵时间对酶活的影响在单因素实验1.2.4.1-1.2.4.3的结果下，分别发酵24、48、72、96、120、144、168、192 h，测量各发酵液的纤维素酶活性。
1.2.4.5 原材料预处理方式对酶活的影响以分别经过超声2 h、5% NaOH静置24 h、5% NaOH超声2 h处理的甘草药渣为基质配制培养基。在发酵培养基起始pH6.0、药渣含量3%、及培养基其它条件不变的情况下，30℃发酵144 h，测量各发酵液的纤维素酶活。以空白组的酶活为100%，计算相对酶活。
1.2.5 草酸青霉G2产酶条件优化在单因子实验基础上，采用对发酵结果影响较大的药渣用量、发酵时间、初始pH值、发酵温度4个因素，进行L9(34)正交实验(见表 1)，以滤纸酶活及内切酶活为指标用于优化草酸青霉G2液体发酵条件。
参考文献[14]，利用G2酶、商品酶1(Sigma)、商品酶2(Novozymes)对甘草药渣进行酶解研究。G2酶组、商品酶1组、商品酶2组中酶的用量为10 U/g(每克甘草药渣)，所有组中固液比1:50(pH4.8的柠檬酸缓冲盐)，空白组最后加入相同量的缓冲液。在50℃、200 r/min的条件下分别酶解24、48、72 h，取样测定葡萄糖含量及总黄酮的含量。依据文献[15]利用葡萄氧化酶法测定葡萄糖量。甘草总黄酮的提取:料液比1:20，70%乙醇超声提取30 min，提取两次，过滤，合并两次滤液。参考文献[16]，测定甘草总黄酮的含量。
2 结果 2.1 甘草药渣降解菌的筛选及鉴定 2.1.1 菌种初筛从腐烂的甘草、土壤中筛选得到25株能以甘草药渣为唯一碳源生长的菌株，其中4株长势最佳，且在纤维素-刚果红平板上透明圈较大。同时，经过液体发酵酶活力初步测定(表 2)，菌株G2最优，故挑选该菌做后续研究。
将菌株G2接种于PDA培养基上28℃培养3 d，菌落平坦或近于平坦，质地绒状，菌丝初为白色后逐渐变为暗绿色，分生孢子易脱落，分生孢子结构大量产生，分生孢子面深橄榄绿色，渗出液缺乏，反面近于无色，可溶性色素缺乏。根据以上特征，参照《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》，菌株可初步判定为半知菌纲(Fungi Imperficti)壳霉目(Sphaeropsidales)杯霉科(Discellaceae)青霉属(Penicillium)。菌株经18S rDNA鉴定为草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)，命名为草酸青霉菌G2。
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| 图 1 草酸青霉菌G2的18S rDNA进化树分析 |
利用甘草药渣作为唯一碳源，考察培养基中不同含量的甘草药渣对酶活的影响。结果如图 2所示。培养基中甘草药渣含量为3%时，滤纸酶和内切酶活均为最高。当药渣含量高于3%时，滤纸酶和内切酶活均开始出现不同程度的降低，尤其是滤纸酶活力降低的较为明显。
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| 图 2 不同含量药渣对酶活的影响 |
图 3为在液态发酵条件下滤纸酶和内切酶活力变化曲线。当培养基的初始pH6-7时，内切酶与滤纸酶活力均较高。当培养基的初始pH3-6时，随着pH的增加内切酶与滤纸酶活力均逐渐增加; 培养基的初始pH大于7时内切酶和滤纸酶活均显著降低，pH8.0时，内切酶与滤纸酶活均到达最低值。
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| 图 3 初始pH对酶活的影响 |
如图 4所示，发酵温度20℃时，酶活力最低。发酵温度30℃时，滤纸酶活和内切酶活均达到最高。当发酵温度高于30℃时，酶活开始下降，内切酶活下降的较为明显，但滤纸酶活下降并不明显。温度为40℃时，内切酶活和滤纸酶活均高于20℃。
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| 图 4 温度对酶活的影响 |
如图 5所示，随着发酵时间的延长，酶活力逐渐升高，发酵144 h时，滤纸酶活和内切酶活均达到最大值。发酵时间低于144 h时，随着发酵时间的增加，滤纸酶活和内切酶活出现不同程度的升高。当发酵时间高于144 h时，此时滤纸酶活和内切酶活开始显著下降。
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| 图 5 发酵时间对酶活的影响 |
以经过不同预处理方式的甘草药渣为基质配制发酵培养基，其对酶活的影响如图 6。结果表明，预处理组的酶活均低于未处理组。其中NaOH超声2 h组，产生的酶活最低。在所有预处理组中，滤纸酶活力下降的水平比内切酶更显著。由于原材料的预处理，导致滤纸酶活力的显著下降，因此采用不经预处理的甘草药渣进行发酵。
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| 图 6 原材料预处理方式酶活的影响 A:超声2 h; B:NaOH超声2 h; C:NaOH静置24 h; D:空白 |
在单因子实验基础上，采用对发酵结果影响较大的发酵温度(A)、初始pH值(B)、药渣含量(C)、发酵时间(D)4个因素，以滤纸酶活及内切酶活为指标，进行L9(34)的正交实验，用于优化草酸青霉G2液体发酵条件。试验安排及结果见表 3，方差分析见表 4。实验结果显示，上述4个因素对滤纸酶活与内切酶活的影响一致。由直观分析可知，4个因素对滤纸酶与内切酶活的影响顺序D＞C＞A＞B。表 4方差分析结果表明，因素C、D的不同水平对滤纸酶活有显著影响(P < 0.05，P < 0.05)，这与直观分析的结果一致。因此，最佳发酵工艺条件为A2B2C2D3，即发酵温度30℃、起始pH6.0、药渣含量3%、发酵时间144 h。
通过正交实验优选出的最佳组合A2B2C2D3，并未出现在正交实验中。因此需要进行工艺验证。结果最优组合的滤纸酶活为3.43 U/mL，较正交试验中的较优组合3.23 U/mL提高了6.2%;内切酶活为16.89 U/mL，高于正交试验中的较优组合16.07 U/mL，提高了5%。因此，G2的最适发酵条件为:甘草药渣含量3%、温度30℃、起始pH6.0、发酵时间144 h。
2.5 甘草药渣的酶解研究如表 5所示，G2酶对甘草药渣的降解作用明显优于商品酶1及商品酶2。在酶解72 h时，G2酶组葡萄糖产量达到最大值121 mg/g，同时总黄酮含量达到68.5 mg/g，与空白组相比总黄酮提取率提高36.2%。酶解72 h时，商品酶1组的葡萄糖产量达到最大值44 mg/g，总黄酮含量达到59.3 mg/g，与空白组相比总黄酮提取率提高17.7%;商品酶2组的葡萄糖产量达到最大值58 mg/g，总黄酮含量达到60.3 mg/g，与空白组相比总黄酮提取率提高了19.6%。
筛选性能优良纤维素酶生产菌，是降低纤维素酶生产成本的有效途径之一[17]。本试验以腐烂的甘草及土壤为筛选对象。同时，为了避免遗漏优良菌种，除了采用传统的刚果红平板法进行初筛外，还以多种纤维素酶活为指标，利用甘草药渣为底物进行液体发酵复筛。最后从腐烂的甘草中筛选出纤维素降解菌G2，结合形态学以及18S rDNA分析结果确定为草酸青霉。目前，关于草酸青霉的研究较多，不同的研究结果表明，菌株发酵产纤维素酶的性能受培养基组成、原料的品质、菌种数量、操作条件等因素的影响。如李洋等[18]研究发现，碳源、氮源、发酵初始pH对草酸青霉菌株产酶性能有显著影响。
本试验考察了药渣含量、发酵温度、发酵起始pH、发酵时间以及原材料预处理方式对草酸青霉G2发酵影响。培养基的碳氮比直接影响了发酵效率和微生物的产酶能力[18]。当培养基中药渣含量发生变化时，其碳氮比也会发生明显变化，从而导致微生物的产酶效率发生不同程度的变化。发酵起始pH6-7时，G2的产酶性能较高; pH﹥7时，G2的产酶性能显著降低。草酸青霉菌适宜在酸性条件下生长[19]，因此当环境pH呈酸性时利于菌体的生长以及菌株发酵性能的提高。发酵时间低于144 h时，随着发酵时间的增加，滤纸酶活和内切酶活出现不同程度的升高，这与生物量逐渐增加以及菌体的活力逐渐达到最大值有关。当发酵时间高于144 h时，此时滤纸酶活和内切酶活显著下降，这可能与发酵液中营养物质的减少以及菌体的活力下降有关。原材料经超声和NaOH处理均能有效的破坏其木质素的结构，从而暴露纤维素[20-21]。但甘草药渣经超声和碱处理以后，酶活却出现了降低，推测是由于实验菌株G2分离于腐烂的甘草，G2的生长可能依赖于甘草中的某些成分如:三萜皂苷、黄酮、多糖及蛋白等。本研究虽然应用的是甘草药渣，对其成分分析结果显示仍含有一定量的这些成分，但这些成分在预处理过程中会大量损失，如超声处理可促进这些成分进入溶媒中，碱处理可破坏这些成分，两者结合会使这些成分的损失更加严重，损失越多越不利于菌株G2的生长，从而导致菌株的产酶效率降低，图 6的结果似乎亦支持这一推测。
正交分析结果表明，药渣含量、发酵时间对菌种的发酵影响较大。同时，还确定了G2的最佳产酶条件:药渣含量3%、温度30℃、起始pH6.0、发酵时间144 h。G2利用优化后的工艺进行发酵，滤纸酶活和内切酶活分别达到了3.43 U/mL和16.89 U/mL，滤纸酶活高于此前报道的草酸青霉IODBF-5液体发酵的酶活2.7 U/mL[22]。
甘草药渣的酶解结果表明，G2酶对甘草药渣的酶解效率高于商品酶1、2。李琼翠等[10]用商品酶酶解甘草药渣葡萄糖产率仅为29.07 mg/g，低于本试验的121 mg/g。商品酶在纯化的过程中，其成分会出现一定程度上的损失，从而导致其酶活降低[23]。因此，有可能导致商品酶在酶解效率上低于G2生产的粗酶液。已有研究表明，生产纤维素酶的底物与酶解底物为同一原材料时，其生产的纤维素酶对该材料的酶解效率更高[12]。
4 结论草酸青霉G2液体发酵甘草药渣可以产生活力较高的纤维素酶，并且该酶能够有效地糖化甘草药渣，同时使药渣中有效成分的提取率得到显著提高。
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