为了实现农产品的高产和稳产，农业生产过程往往会大量的施用化学肥料和农药，致使生态环境日趋严重^[1]。为了农业的可持续发展，现代农业向绿色农业、生态农业方向转变已成为必然，微生物菌剂在其中的作用也日趋突出^[2]。近年来，微生物菌剂被广泛的应用于生物防治中，迄今已有木霉菌^[3]、枯草芽孢杆菌^[4]和哈茨木霉^[5]等微生物菌剂的相关报道，但关于黄赭色链霉菌菌剂的研制尚属空白。

由于微生物菌剂对外界环境因素(湿度、温度和光照等)比较敏感，容易导致菌剂储存的稳定性差^[6]，因此在实际生产微生物菌剂的过程中，可通过添加一些助剂来提高菌剂的稳定性，延长菌剂的保存期限^[7]。目前国内外已有关于助剂对假单胞菌菌剂^[8-9]、解淀粉芽孢杆菌BA-12可湿性粉剂^[10]等的相关报道，而关于助剂对黄赭色链霉菌菌剂的影响鲜有报道。黄赭色链霉菌SN16为本实验室分离筛选并保藏的放线菌，对水稻恶苗病菌、层出镰刀菌、尖孢镰刀菌等有较好的拮抗作用。

因此，本试验将在前期研究工作的基础上，根据黄赭色链霉菌SN16的特性，对载体、保护剂和分散剂等进行筛选，旨在研发出一种便于贮藏的黄赭色链霉菌SN16菌剂，并探究其对小麦幼苗生长的影响，为新型的黄赭色链霉菌SN16菌剂的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

供试菌株为黄赭色链霉菌SN16，由山东农业大学微生物工程实验室提供; 供试小麦品种:“优麦2号”，购自购自泰安市泰山区农大种业。

供试试剂:小米粉、麦麸、硅藻土、非耕作层黄土、高岭土、碳酸钙、碳酸镁、几丁质、羧甲基纤维素钠(CMC)、海藻酸钠、腐植酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、Tween-80。培养基:高氏1号培养基^[11]，固体培养基(小米粉麦麸培养基)。

1.2 方法 1.2.1 黄赭色链霉菌SN16种子液的制备

将保藏的黄赭色链霉菌SN16接入高氏1号培养基平板上活化，28℃培养3 d。然后将菌株SN16接种于装有100 mL高氏1号液体培养基的三角瓶(250 mL)中，于28℃，180 r/min条件下培养48 h，备用。

1.2.2 黄赭色链霉菌SN16原粉的制备

以黄赭色链霉菌SN16固态发酵制备原粉，即80%小米粉与20%麦麸混匀，加入蒸馏水，使初始含水量达到50%，接种量10%，pH自然，28℃培养7 d。待发酵完成后取出培养物，于35℃恒温鼓风干燥。粉碎后即为黄赭色链霉菌SN16原粉，备用。

1.2.3 不同载体对黄赭色链霉菌SN16生长的影响

选用硅藻土、非耕作层黄土、高岭土、碳酸钙、几丁质和碳酸镁等6种材料作为载体，分别以5%的量添加到含该菌的液体高氏1号培养基中，于28℃，180 r/min培养48 h。采用平板菌落计数法^[11]，并观察不同载体下SN16菌落生长情况。

1.2.4 载体对黄赭色链霉菌SN16菌剂的影响

在1.2.3的基础上，将对菌株SN16生长具有促进作用的载体以5:8的比例与黄赭色链霉菌SN16原粉混合，分别包裹于牛皮纸中，以不添加载体的处理组为对照(CK)，置于54℃培养7 d，采用平板菌落计数法测定各处理的存活率。每个处理重复3次。

1.2.5 保护剂的筛选

以腐植酸、海藻酸钠作为保护剂，根据其化学性质，分别配制成0.1%、0.5%和1%浓度的溶液，以5:6的比例与黄赭色链霉菌SN16原粉混合，并于54℃培养7 d。采用平板菌落计数法测定各处理的存活率，每个处理重复3次。

1.2.6 分散剂的筛选

以十二烷基硫酸钠(SDS)、Tween-80和羧甲基纤维素钠(CMC)为分散剂，分别配制成0.1%、0.5%和1%浓度的溶液，以5:6的比例与黄赭色链霉菌SN16原粉混合，并于54℃培养7 d。采用平板菌落计数法测定各处理的存活率，每个处理重复3次。

1.2.7 贮存时间对黄赭色链霉菌SN16菌剂的影响

将优化后的载体、保护剂和分散剂按比例与黄赭色链霉菌SN16原粉混合，分别置于28℃和4℃的环境中储存，以不添加任何物质的原粉为对照组(CK)，于1、7、15、30、45和60 d时定期取样，采用平板菌落计数法测定各处理的活菌数。每个处理重复3次。

1.2.8 黄赭色链霉菌SN16菌剂对小麦幼苗生长的影响

精选大小一致、无病害的小麦种子，经5%的次氯酸钠表面消毒后，播种于含有310 g无菌土的花盆中(下直径10 cm，上直径15.5 cm，高度12.5 cm)，每盆10粒种子。待小麦出芽后对其进行根灌处理，分别取5 mL 1%、2%和3%浓度的SN16菌剂浇于小麦根部，对照组施用等量无菌水，采用完全随机排列。培养期间浇灌清水保持土壤湿润，于培养45 d后测定相关指标。

1.2.9 测定项目及方法

采用平板菌落计数法测定相关活菌数，存活率(%)=第n天活菌数/初始活菌数×100%。

从各个处理组随机选取5株小麦幼苗，采用卷尺测定小麦幼苗的株高和根长; 采用分析天平测定幼苗的株鲜重; 将幼苗于105℃杀青15 min，80℃烘干至恒重后，采用分析天平测定其株干重。

1.2.10 数据处理

试验数据采用SPSS Statistics 22软件分析处理，采用Excel 2010作图，以LSD法做多重比较分析。

2 结果 2.1 黄赭色链霉菌SN16菌粉的助剂优化结果 2.1.1 载体对黄赭色链霉菌菌株SN16活性的影响

由表 1所可知，添加硅藻土和非耕作土的处理，SN16菌株的生物量均显著高于对照(P < 0.05)，添加碳酸钙和高岭土的处理与CK间的差异不显著(P> 0.05)，而添加几丁质和碳酸镁的处理，SN16菌株的生物量均显著低于对照(P < 0.05)。这说明硅藻土与非耕作土对SN16菌株的生长具有促进作用，碳酸钙和高岭土对SN16菌株的生长没有显著影响，而几丁质和碳酸镁对SN16菌株的生长具有抑制作用。因此，硅藻土、非耕作土、碳酸钙和高岭土均可作为载体，而几丁质和碳酸镁不适合作为载体。

2.1.2 不同载体对黄赭色链霉菌SN16菌粉热贮稳定性的影响

硅藻土、非耕作土、碳酸钙和高岭土等4种载体分别和菌粉混匀，于54℃的环境下贮存7 d，发现不同处理的活菌数出现了显著变化(图 1)。平均值多重比较结果(α=0.05)，以硅藻土、碳酸钙为载体的菌粉与非耕作土、高岭土和空白对照的差异显著。表明硅藻土和碳酸钙对菌株的保护作用较好，7 d后菌剂的活菌数分别是CK的3.04倍和2.08倍; 非耕作土和高岭土对菌株的保护作用较差，但活菌数也均高于CK。

2.1.3 保护剂对黄赭色链霉菌SN16菌粉热贮稳定性的影响

由表 2可知，腐植酸可以提高菌粉的热稳定性，当腐植酸添加量为0.1%时，黄赭色链霉菌SN16的存活率达36.54%，与CK相比提高了29.73%，但继续增大腐植酸的添加量，黄赭色链霉菌SN16的活菌数减少，存活率降低。从表 3可知，在热贮存的条件下，随着海藻酸钠浓度的增加，黄赭色链霉菌SN16的活菌数不断减少，存活率也不断降低，其中0.1%浓度的海藻酸钠对黄赭色链霉菌SN16的保护作用最好，存活率达到64.35%，与CK相比提高了58.00%。这表明适宜添加量的腐植酸和海藻酸钠对SN16菌粉具有保护作用。在热贮存7 d后，添加0.1%海藻酸钠的菌粉的存活率比添加了0.1%腐植酸的菌粉高出27.81%，说明添加0.1%海藻酸钠更利于SN16菌粉的贮藏。因此，本研究选取0.1%的海藻酸钠作为保护剂。

2.1.4 分散剂对黄赭色链霉菌SN16菌粉热贮稳定性的影响

由表 4-6可知，在热贮存条件下，添加CMC、SDS和Tween-80后的菌剂存活率明显高于CK。其中，添加1%的CMC的菌粉的存活率为15.70%，添加1%的SDS菌粉存活率为13.62%，添加1%的Tween-80菌粉存活率为14.31%，均与CK差异显著(P < 0.05)。其中以添加1% CMC的菌粉存活率和活菌数最高，分别比CK提高了9.17%、2.45×10⁸ CFU/g，这可能是CMC对孢子的分散和活力的提高都有促进作用。因此，本研究选取1%的CMC为最佳分散剂。

2.1.5 黄赭色链霉菌SN16菌剂有效活菌数的测定

由图 2可知，黄赭色链霉菌SN16在添加的助剂中存活情况随着培养时间的延长而发生改变，添加助剂的菌剂的活菌数均高于CK。添加助剂的菌剂在常温(25℃)下，其活菌数下降迅速，但在15 d后活菌数趋于稳定，到60 d时，活菌数为0.94×10⁸ CFU/g，存活率达到10.00%。添加助剂的菌剂在4℃的贮存条件下，活菌数下降较为缓慢，到60 d时，其活菌数是2.45×10⁸ CFU/g，存活率为24.90%，与不添加任何助剂的CK的存活率相比，高17.34%。说明加入助剂的菌剂比未加入助剂的菌剂更利于贮藏，生物活性更稳定。

2.2 黄赭色链霉菌SN16菌剂对小麦幼苗生长的影响

黄赭色链霉菌SN16菌剂对小麦幼苗生长的影响如表 7所示。施用1%黄赭色链霉菌SN16菌剂的处理(T1)，小麦幼苗的株高比对照提高了9.85%，达到了显著水平(P < 0.05)，而施用2%和3%的处理(T2和T3)，小麦幼苗的株高与对照差异不显著(P> 0.05)。与对照相比，T1和T2的根鲜重与根干重均显著增大(P < 0.05);T1和T2之间，虽然根鲜重差异显著(P < 0.05)，但根干重差异并不显著(P> 0.05);T3的根鲜重与根干重与对照差异不显著(P < 0.05)。综合考虑应用效果和使用成本，宜选择1%为黄赭色链霉菌SN16菌剂最佳施用量。

3 讨论

微生物菌剂的贮存稳定性直接影响其产品质量与应用效果。选择合适的载体和添加保护剂可以提高微生物菌剂的贮存稳定性。硅藻土的主要成分为SiO2，其结构呈微孔状，孔隙度较宽、孔洞排列整齐、吸收性好、比表面积大、耐磨、热稳定好，附着力强，对微生物有保护作用，是生产微生物菌剂常用的载体之一^[12-13]。本研究证实硅藻土作为黄赭色链霉菌SN16的载体，其应用效果优于高岭土、碳酸钙、几丁质等常用载体，这与骞天佑^[16]报道一致。

放线菌具有适应环境的能力强，能够在植物根系和根周围的土壤中定殖，并产生多种抗生素和分泌多种胞外水解酶^[14]，能产生存活时间长的孢子等优点，有利于工业化生产及应用，但放线菌必须与合适的助剂混合到一起，才能发挥更好的作用^[15]。许多性状优良的放线菌制剂已经应用于农业生产中，骞天佑等^[16]采用添加非耕作层黄土的生防放线菌153活菌剂明显提高了茄子的防病能力; 申光辉等^[17]研究表明，硅酸钾与密旋链霉菌Act12菌剂配施可显著促进连作草莓生长，提高果实产量及品质。然而目前国内尚无黄赭色链霉菌菌剂的相关报道。本研究盆栽试验表明，施用一定浓度的黄赭色链霉菌SN16菌剂能够有效促进小麦的根长、株鲜重、株干重，这与田琴^[18]的研究结果相一致。本研究初步确定了黄赭色链霉菌SN16菌剂的各项组分，并探讨了其对小麦幼苗生长的影响，而对于黄赭色链霉菌SN16菌剂在田间的应用效果如何，后续试验对此将进一步深入研究。

4 结论

通过单因素实验确定了菌剂的最佳配方:黄赭色链霉菌SN16原粉20%，海藻酸钠溶液(1 mg/mL)24%，CMC溶液(10 mg/mL)24%，硅藻土32%。添加这3种助剂后，黄赭色链霉菌SN16活体粉剂于4℃保存60 d后其生物量为2.45×10⁸ CFU/g，存活率达到24.90%，常温保存60 d后能达到0.94×10⁸ CFU/g。盆栽实验结果表明，1%浓度的黄赭色链霉菌SN16菌剂能够对小麦幼苗的株高、鲜重、株干重具有显著的促进作用，分别比对照组提高了9.85%、57.90%和66.67%。