2. 农业部阿拉尔作物有害生物科学观测站，阿拉尔 843300;
3. 新疆生产建设兵团第一师阿拉尔农场，阿拉尔 843300
2. Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Alar, Ministry of Agriculture, Alar 843300;
3. Alar Farm of the First Planners in Xinjiang Production and Construction Corps, Alar 843300
转基因抗虫棉在我国种植已有20多年历史[1]，转Bt棉可降低棉田虫害程度，减轻农药污染，已成为我国棉花主栽类型[2-3]。然而，随抗虫棉种植时间推移，其对棉铃虫的防治效果有下降趋势，棉铃虫室内生测也发现2代发生期的转Bt棉叶致死率高于3、4代发生期[4]，这种转Bt棉抗虫性波动与棉花生育期Bt毒蛋白表达呈前期强、中后期弱有关[7]，在空间分布上叶片杀虫蛋白含量高于生殖器官[5-6]。另外，外部环境对Bt蛋白表达也有较大影响，极端低温与湿度互作使Bt棉开花后的抗虫性有明显下降[8]，38℃以上，棉蕾的Bt蛋白表达量均显著下降[9]。施氮肥能明显促进棉叶Bt蛋白的表达，其Bt蛋白表达量与可溶性蛋白、游离氨基酸及全氮含量呈极显著正相关关系[10]。转Bt棉开花后用赤霉酸或缩节胺处理可促进Bt蛋白表达[11]。利用表油菜素内酯、甲哌嗡和水杨酸混合处理能提高转Bt棉在盛蕾期上部叶片、花铃期下部叶片及果枝叶的毒蛋白含量[12]。因而Bt蛋白表达含量波动较大，既与植株内在因素有关，又受外部环境等因素影响。本文以当地较为常见的种植品种为研究对象，通过检测主茎不同叶序棉叶Cry1Ab/c蛋白和总水溶性蛋白含量，分析Cry1Ab/c蛋白含量的时空变化规律，为棉花生产中构建棉铃虫防控体系提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料抗虫棉X-37和M-49，采自阿拉尔垦区棉田。随机选择5株生长一致、叶片大小相近棉花，采集主茎由下往上的第2、4、6、8、10、12、14叶片，于-80℃冰箱保存备用。采样时期分别为现蕾期(6月3日)、初花期(6月27日)、花铃期(8月6日)和铃期(8月26日)。
1.1.2 仪器电子分析天平(AL204，梅特勒-托利多仪器有限公司)、高通量组织研磨器(SCIENTZ-48，宁波新芝生物科技股份有限公司)、酶标仪(Multiskan FC，Thermo)、紫外可见分光光度计(E220，Thermo)、冷冻离心机(X1R，Thermo)、Cry1Ab/c试剂盒(AP003，EnviroLogix公司)。
1.2 方法 1.2.1 样品液的提取用打孔器取转Bt棉叶片直径1 cm，并万分之一天平称重后放入2 mL离心管中，加入PH7.4磷酸-吐温(PBS-T)提取液1.2 mL，置于高通量组织研磨器65 HZ研磨匀浆，在4℃，5 000 r/min离心15 min，取上清液为待测样品液。
1.2.2 水溶性总蛋白质含量测定参考考马斯亮蓝(G-250)染色法[13]:取待测样品液0.1 mL，稀释10倍，分别加入2.5 mL考马斯亮蓝(G-250)、混匀，放置5 min后，于波长595 nm处比色，测定吸光度，并通过标准曲线查的蛋白质含量。
1.2.3 Cry1Ab/c蛋白含量的测定采用EnviroLogix公司Cry1Ab/c的抗体夹心ELISA定量检测试剂盒(AP003)进行Bt蛋白含量测定。
1.2.4 数据处理以Excel 2007进行数据处理及作图，利用SPSS17.0进行多重比较(Duncan氏新复极差检测)相关统计分析。
Cry1Ab/c蛋白含量(ng/g)=Cry1Ab/c蛋白含量(ng)/样品叶片鲜重(g);
Cry1Ab/c蛋白比=Cry1Ab/c蛋白含量(ng/g)/水溶性总蛋白含量(µg/g)
2 结果 2.1 两种转Bt棉Cry1Ab/c蛋白叶片含量的时空分布M-49转Bt棉主茎叶片的Cry1Ab/c蛋白含量由顶端叶片向底层叶片逐渐增加趋势(图 1)，其中现蕾期(6月3日)第2、4叶Cry1Ab/c蛋白含量显著(P < 0.05)高于第6、8叶; 第2、4叶和6叶极显著(P < 0.01)高于第8叶。在初花期(6月27日)第2叶Cry1Ab/c蛋白明显高于其他叶片，达极显著水平(P < 0.01);除第12叶外，其他叶片Cry1Ab/c蛋白含量无明显差异。花铃期(8月6日)和铃期(8月26日)中上部叶片第8、10、12和14叶Cry1Ab/c蛋白均无明显差异。
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| 图 1 M-49转Bt棉Cry1Ab/c蛋白叶片含量的时空分布 注:大写字母代表差异极显著(P < 0.01);小写字母代表差异显著(P < 0.05)，下同 |
X-37转Bt棉主茎叶的Cry1Ab/c蛋白含量由上至下也呈逐渐增加趋势(图 2)。但不同在于现蕾期(6月3日)第2叶Cry1Ab/c蛋白含量显著(P < 0.05)高于第4、6和8叶，其中第6、8叶达极显著水平(P < 0.01)。在初花期(6月27日)第2、4叶的Cry1Ab/c蛋白含量极显著(P < 0.01)高于其他叶片; 第6叶Cry1Ab/c蛋白含量也极显著(P < 0.01)高于第8、10、12和14叶。花铃期(8月6日)第14叶Cry1Ab/c蛋白显著(P < 0.05)低于第8、10和12叶。铃期(8月26日)中上部叶片第10、12和14叶Cry1Ab/c蛋白均无明显差异。
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| 图 2 X-37转Bt棉Cry1Ab/c蛋白叶片含量的时空分布 |
因此，这两种转Bt棉主茎不同叶序棉叶Cry1Ab/c蛋白含量分布均由下至上逐渐减少，随生育期的推进呈先增后降，现蕾期的Cry1Ab/c蛋白含量较高，初花期、花期、花铃期逐渐降低。整体上，X-37主茎叶Cry1Ab/c蛋白含量较高于M-49。
2.2 两种转Bt棉Cry1Ab/c蛋白的总蛋白比分析M-49和X-37两种抗虫棉主茎底层叶片第2、4和6叶Cry1Ab/c蛋白与总蛋白比均无显著差异，花铃期(8月6日)和铃期(8月26日)的第10、12叶Cry1Ab/c蛋白比呈稳定减少趋势(表 1)。但在初花期(6月27日)第10、12和14叶的Cry1Ab/c蛋白比显著(P < 0.05)高于花铃期和铃期。
转Bt基因棉M-49和X-37在时空分布上存在明显差异，主茎叶片Cry1Ab/c蛋白含量由下至上逐渐减少，这与Rochester[14]、余恩等[15]报道一致，如浙大13-1转基因抗虫杂交棉的主茎下部叶Bt蛋白含量显著高于上部叶，但不同于转Bt新棉33B和GK3上部棉叶Bt蛋白含量显著高于老叶[16]，以及浙大13-2和其亲本的两部位叶片Bt蛋白含量差异并不明显[15]。这可能与转基因抗虫棉品种有关系。另外，转Bt棉M-49和X-37生育前期的叶片Cry1Ab/c蛋白含量明显高于生育中后期，这与邢朝柱等[16]和王冬梅等[17]研究结果相近。这种时空分布将会导致新疆南疆棉区的棉铃虫能较好的防治2代棉铃虫，但3、4代棉铃虫防治效果会整体呈现下降趋势[18]。因此，为了避免加速棉铃虫对转Bt棉产生抗性，有必要筛选抗虫表现更好的棉花品种，结合常规棉花布局建立庇护所[19]，更有利于棉铃虫的治理。
转基因棉M-49和X-37主茎上部叶片在生育期后期Cry1Ab/c蛋白含量明显下降。这可能与棉株的外部环境和内在因素的影响较大有关，极端温度、氮肥、盐碱等不良外界因素对Bt杀虫蛋白表达存在影响[8, 10, 14, 20]，在前期棉株体内代谢旺盛，Cry1Ab/c蛋白积累较多，而后期棉花由营养生长转为生殖生长，Cry1Ab/c基因表达受到一定影响[17]。研究表明GPT、GOT等活性与Cry1Ab/c蛋白含量存在极显著的正相关[21]。总体上，组织中Bt杀虫蛋白与总可溶性蛋白含量呈正相关[9, 21]，但不同时期和部位叶片表现有一定差异，而主茎中上部叶片第8、10、12和14叶在初花期的杀虫蛋白比值变化显著较大。此外，棉花生长后期的Bt蛋白含量下降的内因可能由于棉花生长前期Bt基因过量表达，而使后期基因沉默或启动子甲基化[22]; 或因某种降解蛋白酶降解，单宁的结合使其失活[23]。因此，还需进一步明确Bt杀虫蛋白的下降主因，分析初花期后的Cry1Ab/c蛋白比变化内在因素，为更好地指导转Bt基因棉的生产应用提供参考。
4 结论转基因棉M-49和X-37品种主茎叶片Cry1Ab/c蛋白含量存在时空差异，时间上随棉花生育期的推进呈先增后降，同时期由下部至上部叶片逐渐减少，但叶片中的水溶性总蛋白比值有上升趋势。
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