石油和天然气等化石能源消耗量巨大，与国民经济各行各业息息相关，但由于其不可再生的缺陷，使得化石能源逐渐枯竭。即使如今已经发现页岩气和可燃冰能部分的作为替代资源，世界各国仍然在积极地寻找化石能源的替代者，其中可再生的生物质，尤其是植物细胞壁成分(包括多糖及木质素成分)的高效利用和开发成为了研究的重点领域之一。欧盟要求到2020年在所有的燃油中添加10%可再生生物燃料[1]，而美国计划到2025年将30%的燃料从汽油更换为生物燃料[2]。
由于涉及到“与人争地”和“与人争粮”等伦理问题，直接将玉米、红薯等高淀粉粮食作物转化为乙醇的第一代生物燃料技术一直饱受争议，而开发非粮作物如柳枝稷、芒草和利用农作物废弃物如秸秆、稻草、谷壳等资源生产乙醇或高级生物燃料则能实现变废为宝，具有更好的可持续性。在此过程中，首先需要将植物生物质尤其是植物细胞壁成分中的多糖有效的降解、释放为可被酿酒酵母、大肠杆菌等工程微生物利用的单糖或寡糖，再经体内代谢途径转化为乙醇、高级燃料或高附加值化学品。使用酶法降解处理植物细胞壁反应条件温和，能很好的契合下游的发酵过程，但酶的使用成本仍然高企，这限制了开发植物细胞壁生物质生产二代生物燃料。
Caldicellulosiruptor bescii是一株分离于热泉的革兰氏阳性细菌，具有耐热性强(最适生长温度为75℃)、降解木质纤维素能力强的特点。该菌能在多种木质纤维素模式多糖如微晶纤维素Avicel和木聚糖上生长；对未经预处理的能源作物柳枝稷，该菌也能有效的利用和快速生长。它甚至还具有罕见的在厌氧状态下降解木质素的能力。鉴于以上发现，该菌参与降解植物细胞壁多糖的糖苷水解酶及相应的在酶蛋白和微生物层面上降解植物细胞壁多糖的分子机制，近年来得到了广泛的关注和研究。
1 菌株的分离和研究历史1990年，Svetlichnyi等[3]从俄罗斯堪察加半岛的间歇泉山谷一处热泉中分离得到一株极端嗜热和严格厌氧的革兰氏阳性细菌，并将其命名为Anaerocellum thermophilum。在发现之时，人们已经意识到该菌具有宽泛的植物多糖利用谱，且其在纤维素上生长最好。1998年，Zverlov等[4]对分离纯化自A. thermophilum培养液上清中的双催化结构域纤维素酶CelA进行了酶学性质表征，并注意到该菌和Caldicellulosiruptor属细菌代表菌、同样来自热泉的Caldicellulosiruptor saccharolyticus具有高度的相似性。虽然如此，直到2009年，美国乔治亚大学的Yang等[5]在重新评估过去人们所发现的木质纤维素降解菌时，对A. thermophilum做了系统的分析发现，A. thermophilum DSM6725能够有效的降解各种未经预处理的木质纤维素，包括硬木(如白杨)、低木质素草本植物(如象草)和高木质素草本植物(如柳枝稷)。随后，该学者通过细致的分类学研究证明A.thermophilum和Caldicellulosiruptor saccharolyticus同归一属，并将其种名定为“bescii”，其中“besc”是作者所属美国能源部生物能源科学中心(BioEnergy Science Center)的首字母缩写[6]。由于Caldicellulosiruptor bescii最适生长温度为75℃，且其具有强大的木质纤维素降解和利用能力，这意味着该菌的基因组编码有嗜热、高效和针对纤维素、木聚糖等多种植物细胞壁多糖的糖苷水解酶。相对于常见的中温酶，来自于极端嗜热微生物的酶往往具有催化效率高、抗逆性好和货架期长等优点，因此，随着第二波生物能源研究热潮在本世纪初的兴起，C. bescii所编码的酶引人注目，人们在酶基因资源挖掘和在分子生物学和微生物层面上的降解机制进行了许多研究。2009年，Kataeva等[7]完成了对C. bescii DSM6725菌株的基因组测序。该菌基因组大小为2.97 Mb，另外还含有两个染色体外的质粒，大小分别为8.3和3.6 kb。两年后，Dam等[8]对其基因组的详尽分析指出，该菌基因组编码2 666个蛋白质，且其中83%以上蛋白的表达已得到实验证实；与碳水化合物转运和利用相关的基因分别为171和88个。基因水平转移在该菌获得植物细胞壁多糖降解能力，以及快速适应环境方面可能起到了重要的作用。
2 降解植物细胞壁的糖苷水解酶 2.1 纤维素酶C. bescii具有强大的木质纤维素降解能力，其降解微晶纤维素的能力非常突出。Caldicellulosiruptor属中不同种的细菌利用木质纤维素的能力有所差异：在对7种菌的比较中，Blumer-Schuette等[9]发现，C. bescii降解并利用微晶纤维素Avicel作唯一碳源在其上生长的能力与C. saccharolyticus相当，远高于其他5种同属细菌。对C. bescii的基因组注释发现，该菌降解纤维素相关的酶基因多集中于一个植物细胞壁多糖降解利用的基因簇，该基因组所编码的蛋白大多为多结构域双功能酶如纤维素酶/木聚糖酶、纤维素酶/甘露聚糖酶和纤维素酶/木葡聚糖酶等。对8个Caldicellulosiruptor属细菌的基因组学分析发现存在3个核心的多结构域酶，分别为GH9-CBM3c-CBM3b-CBM3b-GH48(CelA或CbCel9A/Cel48A)、GH74-CBM3b-CBM3b-GH48和GH9-CBM3b-CBM3b-CBM3b-GH5(CbCel9B/Man5A)；说明这3个酶存在与否与该属细菌降解纤维素的能力成正相关[10]。在C. bescii中，这3个多结构域的酶以完整形式存在，而在部分其他种的细菌中，它们则可能以完整或断裂的形式存在。
同真菌依赖于GH7和GH6等外切纤维素酶(或称纤维二糖水解酶)分别从还原端或非还原端切割纤维素链不同，细菌主要使用GH48外切纤维素酶从末端切割纤维素。GH48纤维素酶对细菌降解利用纤维素的能力早有研究：将嗜热梭菌里的Cel48S基因敲除大大削弱了其水解纤维素的能力[11]。我们注意到，C. bescii具有丰富的GH48结构域(3个)，而纤维素降解能力较弱的Caldicellulosiruptor属细菌C. hydrothermalis、C. kristjanssonii和C. owensensis则没有GH48外切纤维素酶；另外，C. bescii的3个GH48结构域均和其他一个催化结构域形成N端、C端双催化结构域、多碳水化合物结合结构域的酶，它们分别是GH9-CBM3c-CBM3b-CBM3b-GH48、GH10-CBM3b-CBM3b-GH48(CbXyn10C/Cel48B)和GH74-CBM3b-CBM3b-GH48。
GH9家族蛋白是C. bescii中一种重要的内切葡聚糖酶，和Caldicellulosiruptor属中具有最强纤维素降解能力的另外两个菌类似，C. bescii具有两个GH9同功酶，其中一个以GH9-CBM3c-CBM3b-CBM3b-GH48形式存在，而在具较弱的纤维素降解能力的同属其他细菌中则只有1个GH9基因甚至完全缺失。CbCel9B的最适温度是85℃，最适pH为5.5，C端直接相连的CBM3c和GH9催化结构域形成紧密相互作用的整体，而且，两个CBM3b也有助于其降解Avicel和滤纸等微晶纤维素[12]。CbCel9A对Avicel的活性强于CbCel9B，但对滤纸的活性却弱于CbCel9B[13]。
C. bescii的基因组编码6个GH5家族糖苷水解酶，而在其他已测序的Caldicellulosiruptor属细菌中，GH5的数量是1-6个。C. bescii的这6个GH5家族酶，其中3个是氨基酸序列几乎完全一致的甘露聚糖酶，均以多结构域双功能酶(CbCel9B/Man5A、CbMan5B/Cel44A和CbMan5C/Cel5A)的形式存在，剩下的基因中2个为内切纤维素酶，分别以多结构域双功能酶(CbMan5C/Cel5A)或游离酶(CelD)形式存在；另一个为甘露聚糖酶。与Cel5A不同，CelD主要能降解可溶的或无定型纤维素，降解微晶纤维素的能力非常弱[14]。在CelD蛋白的GH5结构域的C端依次连接有CBM28和3个surface layer homologs(SLHs)，分别与结合特定纤维素成分及将蛋白锚定在细胞壁表面有关。
其他与纤维素降解相关的酶包括CbCel44A，该酶位于多结构域糖苷水解酶CbMan5B/Cel44A的C端，该酶包括一个TIM状模块和一个β-三明治样模块，最适温度是85℃，对Avicel微晶纤维素的降解活性高于其他已报道的同源蛋白[15]。此外，CbCdx1是一个第1家族的糖苷水解酶，能将纤维寡糖降解为葡萄糖[16]。
2.2 半纤维素酶依据植物物种的不同，半纤维素的主要成分包括木聚糖、甘露聚糖等。与木聚糖主链降解相关的主要家族有GH10和GH11家族，C. bescii的木聚糖酶主要属于前者，该家族的酶底物特异性较为宽泛，氨基酸序列的同源性在18.7%-59.5%间；该菌基因组仅编码1个GH11家族的酶，但此家族酶的底物特异性较为严谨。两个主要的GH10木聚糖酶为CbXyn10A和CbXyn10B，位于同一个木聚糖利用的基因簇中，前者具有两个CBM22结构域，后者没有。有文献认为，CBM22结构域兼具底物结合和稳定催化结构域的作用[17]。研究发现，将CbXyn10A上的两个CBM22依次去掉会使酶的最适温度降低10-15℃；然而将这两个CBM22构建在CbXyn10B的N端并不能起到对它的稳定作用，反而使其最适温度降低了25℃[18]。CbXyn10A和CbXyn10B均能降解多种模式木聚糖底物如小麦阿拉伯木聚糖、燕麦木聚糖和桦木木聚糖；尽管它们的氨基酸序列和结构域组织形式大为不同，但都释放以木二糖为主要产物和少量木糖及其他木寡糖作为终产物[18]。与这两个酶不同，CbXyn10C处理小麦阿拉伯木聚糖时以木二糖、木三糖和不同聚合形式、不同支链的木寡糖作为产物[19]。CbXyn10C除了降解木聚糖外，还对大麦葡聚糖有显著活性，且能降解微晶纤维素、酸溶胀纤维素和羧甲基纤维素钠等多种形式的纤维素，在酿酒业中用于发酵液澄清上具有较好的应用价值。由于CbXyn10C兼具木聚糖酶和β-葡聚糖酶活性且活性较高的特点，因此成为研究GH10家族中双功能酶结构和功能对应关系的很好模型。CbXyn10C是多结构域双功能酶(CbXyn10C/Cel48B)的N端结构域，其结构域组织形式以及C端的两个CBM3b-Cel48B和CelA在氨基酸序列上几乎完全一致。由于CelA具有极强的降解纤维素能力，基于CbXyn10C具有明显的纤维素酶酶活，全酶CbXyn10C/Cel48B是否也如CelA一样具有较高的纤维素酶活，在降解复杂植物细胞壁中的木聚糖和纤维素时的表现如何，值得研究。
自然界中的木聚糖一般以异质性、含侧链的形式存在，因此，侧链降解有助于去除木聚糖酶作用时的物理屏障，且由内切木聚糖酶产生的木二糖和木寡糖需要经过木糖苷酶降解成为木单糖方能被细菌转化进入代谢途径。在C. bescii中，与木聚糖侧链和木寡糖降解相关的辅助酶至少存在于GH3、GH5、GH39、GH43、GH51、GH67和CE7等家族中。所有已测序的Caldicellulosiruptor属细菌均至少包括1个GH3家族的酶。对C. bescii的CbXyl3A分析发现，该酶的最适温度为90℃，最适pH为6.0，能将聚合度为2-6的木寡糖降解为木糖；而其阿拉伯呋喃糖苷酶(GH51) 和α-葡萄糖醛酸酶(GH67) 的最适温度分别为90℃和70-75℃[18]。
在Caldicellulosiruptor属细菌中，与甘露聚糖降解相关的酶归属于GH2、GH5、GH26和GH36家族。在C. bescii中，3个氨基酸序列几乎完全一致的GH5甘露聚糖酶均以多结构域双功能酶的形式存在于一个大蛋白的N端或C端。从对CbCel9B/Man5A的表征看，这些甘露聚糖酶具备很强的降解不同类型甘露聚糖(角豆角、瓜尔豆胶和魔芋多糖)的能力，还能降解聚合度为3以上的甘露寡糖[12]。蛋白质组学分析表明，在纤维素培养基上CbCel9B/Man5A的分泌量仅次于CelA[20]。因此该酶在降解利用纤维素和甘露聚糖等植物细胞壁多糖时具有重要意义。
β-甘露糖苷酶将甘露寡糖完全降解为甘露糖(单糖)，便于进入细胞的代谢途径。β-甘露糖苷酶存在于GH1、GH2和GH5家族中。C. bescii中GH1家族的CbCdx1是一个多功能酶，能降解纤维寡糖、木寡糖等，但不能降解甘露寡糖。如上所述，GH5家族的3个序列极相似的酶均为甘露聚糖酶，第4和第5个酶为纤维素酶，而第5个酶则只对甘露聚糖有微弱活性，不能降解甘露寡糖。这意味着甘露寡糖酶必然存在于GH2中。从基因组DNA中克隆了Athe_0227，并将其命名为CbMan2A，该酶能将甘露二糖至甘露六糖降解为甘露糖，并与甘露聚糖酶展现出一定的协同降解作用。CbMan2A没有信号肽，因此，从这些生化数据可推断，多结构域双功能酶在胞外降解甘露聚糖，所形成的甘露寡糖通过细胞膜上某种未知的转运蛋白进入胞内，然后被CbMan2A降解为单糖进入代谢途径[21]。
3 木质素降解对木质素的酶催化降解，现有研究多集中于有氧状态下的酶催化降解，这是因为一般认为木质素的降解必须需要氧气的参与才能打开木质素的主体结构，即难降解的醚键和苯环。而对无氧状态下的木质素降解研究得非常少。木质素伴生于植物细胞壁多糖，虽然多糖的降解既能在有氧(水解+加氧裂解)也能在无氧(水解)状态下进行。但无氧环境下木质素的主要结构如何降解(醚键、酯键)或开环(苯环)并最终矿化为二氧化碳实现碳元素的循环还是一个未知的领域。反刍动物的瘤胃为天然无氧、高效降解木质纤维素的特异生物反应器，某些瘤胃细菌的培养物或发酵产物能在厌氧培养时降解木质素或其模型化合物，但其分子机制尚不明确[22-23]。厌氧细菌变形菌Sphingobium属细菌有Cα脱氢酶Lig D、β-酯酶LigF和谷胱甘肽裂解酶LigG，这3个酶能协同作用，在辅基NAD+/NADH的作用下，降解木质素模型化合物1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-(2-methoxyphenoxy)-1，3-propanediol和木质素中的β-O-4芳香醚键[24-25]。值得注意的是，以柳枝稷为能源作物时，C. bescii能在降解纤维素和木聚糖的同时，厌氧降解木质素并释放出木质素的小分子化合物如对香豆酸等。但与植物细胞壁多糖被降解进而利用不同，C. bescii只能降解木质素却没有证据表明其能有效利用木质素降解小分子维持其生长[26]。对C. bescii的基因组分析并未发现和Lig D、LigF和LigG同源的蛋白，这意味着该菌采取的木质素降解机制与Sphingobium属细菌不同。在C. bescii的蛋白质组和转录组学分析中发现了一些具有信号肽的酯酶和“假定蛋白”(hypothetical proteins)，由于厌氧降解木质素在生物能源、生物化工和畜牧养殖等行业均有重要的应用价值，这些蛋白是否参与到木质素的厌氧降解是将来需要研究的重要课题。
4 木质纤维素降解的分子机制 4.1 双催化结构域组织形式在C. bescii中，GH9-CBM3c-CBM3b-CBM3b-GH48被称为CelA[4]或CbCel9A/Cel48A[13]。GH9和GH48分别为内切和外切纤维素酶，能协同降解纤维素。受限于酶的自身特性(进行性，Processi-vity)，不管以内切还是外切方式切割纤维素的糖苷水解酶在降解一定链长后均会从纤维素上脱落，由于GH9、GH48和中间的3个CBMs均具有结合纤维素的能力，这使得解离的催化结构域又能很快找到纤维素底物。这种分子内协同效应和较强的底物结合能力使得CelA具有高效降解微晶纤维素的能力[4, 27]。显然，这种高效降解底物的能力与CelA独特的结构域组织形式是密切相关的；而这种结构域组织形式被认为可能反映了自然界继自由酶(Free enzyme，以里氏木霉的纤维素酶为代表)和纤维小体(Cellulosome，以嗜热梭菌的纤维小体为代表)后的第三种降解纤维素的范式，是一种处于自由酶和纤维小体之间、过渡态的降解形式[27]。除了CelA，C. bescii还编码5个此类双催化结构域酶，在多肽链的N端和C端分别是不同家族的糖苷水解酶，间隔以2-3个碳水化合物结合结构域。除CelA为纤维素酶外，其余5个酶均为双功能酶，针对植物细胞壁多糖的不同成分。考虑到CelA对微晶纤维素的强大降解能力，由于未经预处理的植物细胞壁多糖在物理上紧密相连，这种特殊的结构域组织形式是否对这类酶降解完整植物细胞壁也有类似的促进作用，值得进一步研究。
4.2 底物杂泛性不同的糖苷水解酶具有不同的底物专一性。如前所述，相对于GH10家族的木聚糖酶，GH11酶具有更严格的底物专一性。从已分析的C. bescii的糖苷水解酶来看，该菌的多个GH均具有较宽泛的底物特异性。例如，CbCel9B除了能降解纤维素外，还能降解甘露聚糖[12]。相似的，CbCel44A还能降解甘露聚糖和木聚糖；而CbCdx1则能降解pNP-α-L-arabinopyranoside、pNP-β-D-fucopyranoside、pNP-β-D-galactopyranoside、pNP-β-D-glucopyranoside、pNP-β-D-xylopyranoside和pNP-β-D-cellobiose[16]。CbXyn10B[28]和CbXyn10C[19]除了能降解木聚糖，还能降解纤维素；CelA的GH48外切纤维素酶还具有降解木聚糖的活性[27]。这种广泛存在的糖苷水解酶的底物杂泛性是否有利于该菌更好的适应环境尚未做过系统的研究。但显然并非可有可无：单独添加CelA就能使柳枝稷中超过60%的木聚糖被降解。而且，从节约酶的使用成本角度上，新的双功能酶或多功能酶或改造既有酶获得新功能[29]在工业上具有一定的应用价值。
4.3 吸附-降解模式Caldicellulosiruptor属细菌进化出了一系列的机制使得糖苷水解酶和底物、细菌和木质纤维素能更好的吸附在一起，从而有利于木质纤维素的酶解，如C. kronotskyensis编码有19个含SLH结构域的蛋白，将其中一个基因(Calkro_0402) 插入C. bescii能促使其降解木聚糖。C. bescii有12个含SLH结构域的蛋白，其中CelD是能降解无定型或可溶纤维素的纤维素酶，其余SLH蛋白的功能尚有待进一步研究。此外，在C. bescii的培养物上清中存在许多的solute-binding proteins(SBP)，这些蛋白的pI值偏碱，对木质纤维素有良好的结合能力，推测这些蛋白能通过结合木质纤维素，再通过和pI偏酸的糖苷水解酶的非特异的蛋白间相互作用，促进C. bescii所分泌的糖苷水解酶降解木质纤维素[30]。在固型木质纤维素作底物的培养基中，C. bescii主要通过吸附在木质纤维素上发挥降解和利用作用。在具有较强纤维素降解能力的Caldicellulosiruptor属细菌中发现了Tāpirin这类新的黏附蛋白，基因组中位于编码Ⅳ型菌毛操纵子的下游，生化分析表明它们能结合在模式纤维素和复杂植物细胞壁上，结构分析则表明这类蛋白具有全新、独一无二的结构[31]。对C. bescii的基因组分析发现，该菌具有两个Tāpirin的同源蛋白，可能参与了木质纤维素的吸附和降解利用。
5 结语C. bescii降解木质纤维素的强大能力，与该菌基因组编码的多种针对不同底物的糖苷水解酶、酯酶、碳水化合物结合结构域甚至假定蛋白有密不可分的关系。由于该菌最适生长温度高，从C. bescii中克隆、表达得到的重组酶往往具有优秀的耐热性和较高的催化效率，这为实际应用木质纤维素降解酶奠定良好的基础。更为重要的是，C. bescii采取了多种独特的、异于其他木质纤维素降解微生物的策略进行植物生物质的降解。将来对这些分子机制的进一步阐明和利用无疑可更好的促进高效、多功能高效木质纤维素降解酶的设计和优化。目前对C. bescii的研究，主要集中在对其糖苷水解酶的基因资源挖掘和降解的分子机制的研究，未来可对其降解木质素的酶进行生化分析和基因资源的挖掘。另外，国外已有对C. bescii进行遗传改造的研究，可借鉴已有工作基础，进一步改造该菌使其能高效的将植物细胞壁多糖联合生物加工转化成所需的物质(如氢气或乙醇等)，这些工作在生物能源领域将有重要的意义。
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