土壤是生物与环境之间物质循环和能量转化的重要场所之一，其中蕴含着丰富的微生物资源。土壤微生物参与土壤中诸多的生物化学过程，包括土壤有机质的分解、腐殖质的形成、氮磷钾碳等营养元素的转化和循环、菌根的形成等，是土壤生态系统的重要组成部分^[1]。转基因作物及其外源基因表达产物进入土壤后，可能与土壤微生物相互作用而影响微生物的活动过程^[2]。因此，转基因作物对土壤微生物数量、群落功能、结构多样性的影响是评价转基因作物环境安全性的重要指标之一。

土壤微生物多样性是指土壤生态系统中所包含的微生物的种类、这些微生物所携带的基因及其与环境之间相互关联的多样化程度等。目前，对土壤微生物多样性影响的研究方法大致可归为3类，即基于传统的培养分离法、基于生物化学成分分析法和基于现代分子水平的分析法^[3]。在本文中，分析了几种常用于转基因作物对土壤微生物多样性影响的研究方法，可望通过综合使用多种方法以得到更加真实准确的研究数据。

1 微生物培养计数法

土壤微生物的物种多样性是指土壤中微生物的物种丰富度以及均一度等指标的多样性，目前主要通过传统的分离培养法来研究土壤中可培养微生物的物种多样性。微生物平板培养法是一种传统的方法，它根据靶标微生物特性，采用相应的特定培养基对土壤中的微生物进行培养分离^[4]。但由于培养技术和方法的局限性，使得能够被培养的土壤微生物物种的数量只占实际微生物总数的0.1%-1%，因此不能提供反映微生物群落结构与物种多样性的绝大部分信息^[5-6]。但这种传统培养方法所发挥的作用不容忽视。

由于方法简单方便，至今仍然是一种不可替代的研究手段。Zeng等^[7]通过平板培养试验研究发现，转BcWRKY1基因耐盐玉米对土壤细菌、真菌和放线菌数量均没有显著性影响。Wu等^[8]通过平板培养试验，结果也表明添加转CryIAb基因水稻品系稻杆的土壤中可培养细菌、放线菌和真菌的数量，与添加非转基因水稻品系稻杆的土壤中的相比，没有显著差异；而氨氧化细菌、固氮细菌和纤维素降解细菌的种群数量在试验中期出现暂时的显著性差异。周琳等^[9]对转chi+rip双价抗真菌基因大豆G0431及其亲本非转基因大豆黑农35种植后的根部土壤可培养微生物进行平板培养计数，发现二者根部土壤中的可培养细菌、真菌和放线菌的数量并无显著差异。Zhang等^[10]采用平板培养计数方法研究发现，与受体品种相比，转CrylAc和CpTI基因棉花SGK321对根际细菌、真菌和放线菌群落数量没有显著性影响。燕丽萍等^[11]采用平板培养计数法，以转BADH基因苜蓿和非转基因苜蓿为材料，连续2年测定这两种苜蓿根际可培养细菌、放线菌和真菌数量的变化，结果表明，不同年份和不同月份转基因苜蓿与非转基因苜蓿根际土壤3大类可培养微生物数量变化的趋势一致。

由于微生物群落及其生存环境的复杂多变，在进行新培养技术的研发和实际应用的同时，还应结合现代生物技术方法，才能更客观、全面地反映出微生物群落结构与物种多样性的真实信息。

2 生物标记物法——磷脂脂肪酸图谱分析

土壤微生物的结构多样性是指土壤生态系统中微生物的细胞结构组分等方面的多样化程度，这是导致微生物代谢方式和生理功能多样化等的直接原因。目前一般采用生物标记法来研究土壤微生物群落结构的组成。生物标记物通常是细胞外分泌产物或微生物细胞的生化组成成分，它的总量一般与对应的生物量呈正相关。因此，对特异的生物标记物种类及丰度进行检测可间接反映出样本中的微生物种类、丰度及群落结构，最主要的生物标记物分析法是磷脂脂肪酸法^{[3, 12]}。磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）是细胞膜的重要组成成分之一，不同类群的微生物可形成特定的PLFA。该方法通过直接提取根际微生物的脂肪酸，能够直观地反映出根际微生物群落的组成^[13]。

Nam等^[14]采用PFLA方法，研究了高水平表达细胞分裂素的转基因杨树品系T1403、T1410和T1413对土壤微生物的影响发现，转基因杨树与受体杨树相比，对根际微生物存在暂时的影响。桂恒等^[15]利用PLFA方法分析了富含硫氨基酸转基因大豆对土壤微生物群落结构的影响，结果表明，与非转基因大豆相比，转基因大豆品系根际微生物群落的结构发生了明显的变化。李永山等^[16]利用PLFA方法研究了转Bt基因棉花对土壤微生物群落结构变化的影响发现，与受体棉花相比，转基因棉花的种植增加了土壤微生物PLFA的含量。

PLFA分析法主要表现在不需要对土壤微生物进行分离培养，避免了人为分离培养过程中的误差，同时也可涵盖土壤中大部分不能被培养的微生物。但是，PLFA分析法不能将土壤中存在的某些脂肪酸与特定微生物对应起来，不能从物种的水平上对微生物进行描述，不同种类微生物的特征脂肪酸也可能发生重叠^[17]。因此，在采用PLFA方法对土壤微生物群落多样性分析时，还需结合其他研究方法，才能得到更客观真实的结果。

3 Biolog ECO微平板法

土壤微生物群落功能多样性是指土壤微生物能够执行的功能范围及过程，包括氧化还原、分解转化、营养传递等功能，是描述土壤微生物群落特征的一个重要指标。对土壤生态系统中微生物功能多样性的研究最为常用的方法是Biolog微平板分析法。Biolog ECO微平板是特别为群落分析和微生态研究设计的，包含用于土壤群落分析最常用的31种碳源，通过测定并分析不同微生物群落对Biolog ECO微平板中各种单一碳源底物的利用能力的差异，从而获得微生物群落功能多样性方面的信息^[1]。将Biolog ECO微平板应用于转基因作物对根际微生物群落功能影响的分析，为评价转基因作物对土壤微生物的影响提供了新的思路。

陈丰等^[18]利用Biolog ECO系统分析了富含硫氨基酸转基因大豆对土壤微生物群落功能多样性的影响，结果显示，转基因大豆根际微生物群落功能多样性与受体大豆的相比，二者之间没有显著性差异。Liang等^[19]通过Biolog ECO微孔板分析了转基因高蛋氨酸大豆对根际微生物群落碳代谢功能的影响，结果表明，与受体大豆相比，转基因大豆对根际微生物功能多样性无显著性影响。Wei等^[20]利用Biolog ECO系统分析了转Bt基因水稻SHK601对根际微生物群落功能的影响，结果表明，与受体水稻相比，转基因水稻对根际微生物群落功能有短暂影响。

Biolog ECO微孔板试验成本较高，检测的主要是代谢能力较强的微生物，且外部培养环境的改变有可能引起微生物对底物利用的改变^[21]。此外，Biolog ECO微孔板所表征的代谢多样性并不能完全代表原位生态系统中微生物代谢的多样性^[22]。所以，Biolog ECO微孔板在准确性方面仍有一定的局限性，使用Biolog ECO微孔板法时，如能结合其他研究方法，依然可获得较全面的结果。

4 现代分子生物学方法

土壤微生物的遗传多样性是指土壤生态系统中的微生物在基因水平上所携带的遗传物质和遗传信息的总和。土壤微生物遗传多样性的分析方法主要是基于PCR的分析方法。随着分子生物学技术的发展，直接提取土壤微生物总DNA并进行分子生物学分析，可有效避免传统微生物培养过程中不可培养微生物的丢失，达到更直接、可靠、全面的了解土壤微生物群落原始组成的目的。这些分子生物学方法主要包括变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、实时荧光定量PCR和16S rRNA基因（16S rDNA）可变区扩增子高通量测序、宏基因组高通量测序及生物信息学分析等方法。

4.1 变性梯度凝胶电泳（DGGE）图谱技术

DGGE的原理是长度相同但序列不同的DNA片段在含有变性剂并呈梯度分布的聚丙烯酰胺凝胶上，因解链行为不同而导致迁移速率不同^[23]。该技术已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。目前，国内外很多学者运用DGGE技术进行了转基因作物对根际微生物影响的研究。

浦传亮等^[24]采用该技术对转基因高蛋氨酸大豆根际细菌群落结构进行研究，结果表明，与受体大豆相比，转基因高蛋氨酸大豆对根际细菌群落多样性有一定的降低作用，但这一作用随大豆的生长而逐渐减弱，到成熟期已完全消失。Wu等^[25]运用该技术分析了抗小麦黄花叶病毒转基因小麦对根际细菌、真菌群落结构的影响，结果表明，与受体小麦相比，转基因抗病小麦对根际细菌、真菌群落结构没有显著影响。Wei等^[20]利用该技术分析了转Bt基因水稻SHK601对根际细菌、真菌和放线菌群落结构的影响，结果表明，与受体水稻相比，转基因水稻对根际微生物群落结构无显著性影响。Weinert等^[26]利用该技术分析产玉米黄质转基因马铃薯根际微生物的变化，发现马铃薯不同品种对植物根际细菌和真菌种群的影响要远大于转基因因素。Zhang和Xie等^[27-28]分别利用该技术分析发现，与受体棉花相比，转Cry1Ab/Ac基因棉花对根际真菌、放线菌群落结构没有显著性影响。

虽然DGGE技术在分析土壤微生物多样性方面有很多优势，也已经普遍应用到土壤微生物群落多样性分析的研究中，但是DGGE技术也存在一些不足之处。例如，只能分离较小的片段，不易鉴定到种的水平，PCR产物的突变和DGGE电泳时出现的共迁移都可能影响结果的准确性，耗时耗力，而且只能检测土壤中很小一部分微生物等^[29]。

4.2 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进度，并通过标准曲线对待测样品进行定量分析。目前，该技术已广泛应用到转基因作物对土壤微生物影响的研究中。

该方法可以定量检测土壤中目的菌种的含量以及分布等信息。Liang等^[30]利用该技术研究发现，与受体大豆相比，转基因高蛋氨酸大豆ZD91对根际固氮细菌、氨氧化细菌和反硝化细菌数量无显著性影响。杜娟等^[31]运用该技术分析了转TaDREB4基因抗旱小麦根际中荧光假单胞菌数量的变化，结果表明各生育期转基因小麦和非转基因小麦的根际中荧光假单胞菌的拷贝数之间无显著差异。Zhang和Xie等^[27-28]分别利用该技术分析发现，与受体棉花相比，转Cry1Ab/Ac基因棉花对根际真菌、放线菌数量没有显著性影响。

实时荧光定量PCR具有高灵敏度、高精度、高特异性、实时性等优点，但是，该技术也有一些不足之处，如成本比较高，操作时还要考虑同源和异源DNA的背景、寡核苷酸杂交的特异性、荧光染料或特异性探针的浓度，以及PCR产物的大小等因素，这些因素都会引起结果的偏差。

4.3 高通量测序及生物信息学方法

高通量测序技术能够对数以百万计的DNA分子进行同时测序，不需要对各单一种类的微生物个体进行分离和培养，已广泛应用于土壤微生物遗传多样性的研究领域中^[32]。

4.3.1 土壤样品中微生物可变区扩增子高通量测序

首先提取样品中微生物总DNA，然后运用PCR技术扩增细菌基因组中的16S rDNA、真菌基因组中的18S rDNA或ITS区域，获得绝大部分微生物16S rDNA、18S rDNA或ITS高可变区的扩增产物，并构建扩增产物的文库，利用第二代测序平台进行大规模高通量测序，然后比较分析测序数据，该方法最近几年已广泛应用于转基因作物对土壤微生物群落多样性影响的研究。

4.3.2 土壤样品中微生物宏基因组测序

土壤的宏基因组测序也称全基因组测序，首先提取土壤中的微生物群体基因组DNA，然后把这些微生物的基因组DNA用鸟枪法建库，检测合格后，利用高通量测序平台，原始数据经过数据处理分析，研究土壤中微生物的群体的多样性等指标，相比16S rDNA可变区扩增子高通量测序，该测序方法能够更全面的分析微生物的物种及基因等方面的多样性。

Liang等^{[30, 33]}通过Pyrosequencing测序和克隆文库构建的方法，研究了转基因高蛋氨酸大豆ZD91对根际细菌和丛枝菌根真菌群落结构的影响，结果表明转基因大豆ZD91对根际细菌和丛枝菌根真菌群落结构没有显著性影响，且发现大豆生长时期和年份是主要的影响因素。Lu等^[34]利用Illumina Miseq测序平台研究了转基因耐草甘膦大豆NZL06-698对根际细菌群落结构的影响，结果发现转基因大豆NZL06-698对细菌alpha多样性指数没有显著性影响，然而对beta多样性指数有影响，且对包括固氮菌在内的部分细菌门和属有显著性影响。Lu等^[35]利用Metagenome Sequencing分析了转基因耐草甘膦大豆ZUTS31在鼓粒期对根际微生物群落结构的影响，结果表明，与清水处理对照相比，喷施草甘膦的转基因大豆ZUTS31对根际细菌alpha和beta多样性指数没有显著性影响，然而氮固定相关基因相对丰度显著性降低，产生的原因和机制目前还不清楚。

此类方法可准确检测不同基因型植物的根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异，是判断和评价不同基因型植物对土壤微生物影响的重要方法之一，也是评估转基因作物对土壤微生态风险的重要手段。

5 展望

转基因作物被引入到农田后对包含土壤微生物在内的土壤生态系统的潜在风险已受到人们的广泛关注。目前，随着DNA高通量测序技术飞速发展，测序成本明显下降，16S rDNA测序等高通量方法为研究微生物群落结构与功能等提供了一种新的选择，同时为研究转基因作物种植对土壤微生物多样性的影响提供了一种重要的评价手段。另外，由于土壤微生物群落组成复杂，将各种技术方法有机结合起来全面反映根际微生物群落结构组成与多样性已成为研究的必然趋势。