2. 浙江省环境监测中心，杭州 310012
2. Zhejiang Environmental Monitoring Centre, Hangzhou 310012
水体富营养化已经是全球面临的重大水环境问题，人类活动中氮磷等营养元素进入水体是导致富营养化的主要原因，由于磷是水体藻类生长的限制因子[1]，因此，控制磷的排放比控制氮的排放更具有实际意义。强化生物除磷(Enhanced biological phosphorus removal，EBPR)工艺作为经济、可持续的除磷方法在污水处理厂中得到广泛应用[2]。EBPR工艺通过活性污泥处理污水过程中厌氧阶段和好氧阶段的交替运行，为系统中某些能够“超量吸磷”的微生物营造合适的生长条件，磷随着好氧阶段末端的排泥得到去除。
EBPR系统高效稳定运行的关键是体系中微生物群落组成合理、功能完整。近30年来很多研究者对该系统主要功能微生物进行了大量的研究，但仍未能全面深入了解系统中微生物的群落结构组成、功能和影响因素。此外，很多学者也尝试从该体系中获得纯培养的功能菌株，在人工控制条件下将其重新添加到体系中，以恢复或增强EBPR的除磷效果。
因此，本文从微生物学的角度对EBPR系统进行综述，重点关注功能微生物的组成、影响因素和高效聚磷菌的获取方法。在厘清功能微生物种群、寻找获取高效聚磷菌新方法的基础上，旨为EBPR系统的高效稳定运行提供技术参考。
1 EBPR系统中功能微生物及影响因素 1.1 主要功能微生物EBPR系统中存在大量微生物，包括非细胞型的病毒和细胞型的古生菌、细菌、真菌和微型藻类等[3]，其中功能微生物是研究者们关注的重点。这类微生物除了具有聚磷能力的聚磷菌(Polyphosphate-accumulating organisms，PAOs)外，还包括没有聚磷能力的非聚磷菌(non-PAOs)，主要包括聚糖菌(Glycogen-accumulating organisms，GAOs)和一些辅助细菌等[4]。
1.1.1 聚磷菌聚磷菌是指具有厌氧释磷、好氧吸磷特性的一类微生物。它们可以在厌氧条件下分解多聚磷酸盐(Polyphosphates，poly-P)，以正磷酸盐的形式释放到细胞外，同时利用释放的能量合成聚羟基链烷酸(Polyhydroxylkanoates，PHAs)；在好氧阶段，PAOs可以过量摄取水中溶解态正磷酸盐合成多聚磷酸盐储存在细胞体内，随着剩余污泥排出污水处理系统，从而达到生物除磷的目的。
γ-变形菌纲(γ-protebacteria)的不动杆菌(Acinetobacter)是最早发现能够去除EBPR系统中磷的微生物。40多年前，研究者们开始尝试用纯培养的方法从EBPR系统中分离出具有聚磷能力的单菌株。1975年，Fuhs等[3]首次运用该方法获得一株能够聚磷的不动杆菌。在后来很长一段时间内不动杆菌都被认为是EBPR系统中唯一的PAOs，大量的研究也集中在不动杆菌上[5-7]。然而，研究发现不动杆菌不符合PAOs的代谢模型[8]，因此不是主要的聚磷菌。
随着分子生物学技术的广泛应用，研究者们发现在污水处理厂规模运行的EBPR系统中，不动杆菌的丰度要远小于β-变形菌(β-proteobacteria)和放线菌(Actinobacteria)等其他微生物[9]。Che等[10]运用电子显微镜和16S rRNA基因测序等方法分析了SBR活性污泥的微生物群落，结果发现β-变形菌是最丰富的微生物，负责系统中磷和COD的去除。
四球虫属(Tetrasphaera)被认为是EBPR系统中具有聚磷能力的微生物。Kristiansen等[11]研究发现，在丹麦污水处理厂的活性污泥中，四球虫属丰度很高，占据重要生态位，而且四球虫属的微生物不仅可以聚磷，在反硝化与发酵过程中也起着重要作用。
目前公认的聚磷能力最强、研究最多的PAOs是一类属于β-变形菌纲红环菌属(Rho-docyclacae)的菌株[12]，Hesselmann等[13]最早将它命名为“Candidatus Accumulibacter phosphatis”，通常缩写为“Accumulibacter”。
最新研究[14]显示，在侧流EBPR系统中，PAOs具有很高的丰度，微生物群落结构分析表明，反应器中主要存在的微生物是变形菌门(特别是β-变形菌纲和γ-变形菌纲)；对细菌进一步分析表明，多种微生物属于PAOs，包括Accumulibacter、四球虫属、红环菌属以及反硝化聚磷菌(Denitrifying phosphate-accumulating organisms，DPAOs)。
目前，从实验室到污水处理厂规模的EBPR系统中发现的PAOs种类很多，除上述的不动杆菌、放线菌、四球虫属、红环菌属及Accumulibacter外，希瓦氏菌(Shewanella)[15]、假单胞菌(Pseudomonas)、气单胞菌(Aeromonas)、聚磷小月菌(Microlunatus phosphovorus)、俊片菌(Lampropedia)等[16]都是PAOs，具有聚磷能力。
1.1.2 聚糖菌GAOs的代谢机制与PAOs类似，它们可以在厌氧条件下分解糖原，同时合成聚羟基链烷酸(PHAs)以储存释放的能量；在好氧阶段，GAOs消耗PHAs合成糖原。与PAOs相同，20多年前开始的关于GAOs的研究也是试图寻找符合GAOs代谢模型的微生物。Cech等[17-18]在以葡萄糖和乙酸盐为碳源的系统中观察到大量排列成四分体的球形细胞，但是在厌氧条件下没有正磷酸盐释放，他们将这种生物称为“G细菌”。随后有研究者根据其形态将其称为“Tetrad-forming organisms(TFOs)”[19]。GAOs这一术语是Mino等[20]提出，该定义是基于其好氧阶段合成糖原的代谢特性而不是其形态类型。目前，研究者们关注最多的GAOs是“Candidatus Competibacter phosphatis”，通常简称为Competibacter，属于γ-变形菌纲[21]；另一种主要GAOs的发育地位近似Defluviicoccus vanus，通常简称为Defluviicoccus，属于α-变形菌纲[22]。
GAOs不能储存多聚磷酸盐，对于EBPR系统中磷酸盐的去除没有贡献。而且，GAOs与PAOs争夺底物，抑制PAOs生长，从而对磷酸盐的去除产生负面影响[23]。Mielczarek等[24]调查了丹麦28个污水处理厂规模运行的EBPR系统，结果发现除磷效率降低往往伴随着GAOs的累积。
由于PAOs和GAOs代谢机制十分相似，有学者提出PAOs在一定条件下是否可以转化成GAOs？早前的研究[25]表明，当细胞内Poly-P耗尽时，PAOs在厌氧条件下不能摄取乙酸。但是，也有研究得出了不同的结论。Zhou等[26]使用富含80%典型聚磷菌Accumulibacter的污泥，在厌氧和Poly-P限制条件下研究这些微生物利用乙酸的能力。他们发现，3个周期之后，几乎没有正磷酸盐的释放，但是PAOs仍然能够吸收乙酸并将其储存为PHAs，而糖原降解的显著增加表明PAOs以糖原为主要能源，这表现出了GAOs的关键特征。
1.1.3 其他微生物发酵细菌和水解细菌等也是EBPR系统中的重要微生物，它们通过发酵和水解作用将大分子有机物分解为功能微生物可直接利用的小分子，为其提供碳源和能量。这些细菌与PAOs、GAOs及相关微生物一起构成EBPR系统中完整的群落结构，保证系统发挥良好的除磷性能。
放线菌门和厚壁菌门(Firmicutes)是发酵细菌两个主要门类。Jeppe等运用同位素标记的RNA探针鉴定了污水处理厂规模运行的EBPR系统中葡萄糖发酵细菌的种类和丰度，结果发现四球虫属、丙酸杆菌(Propionicimonas)和乳球菌(Lactococcus)、链球菌(Streptococcus)是主要的葡萄糖发酵细菌，它们都属于革兰氏阳性菌[27]。在10个污水处理厂规模的EBPR系统中，这4种细菌平均共占总生物体积的39%，其中四球虫属是最丰富的葡萄糖发酵细菌，占总生物体积的33%，丙酸杆菌、链球菌和乳球菌分别占4%、1%和0.4%。有研究发现甘露糖和半乳糖可以被发酵为乙酸、丙酸、乳酸和甲酸等挥发性脂肪酸，但是何种微生物的作用尚不明确。此外，丝状细菌、四球虫属和微丝菌属(Microthrix)分别被认为是EBPR系统中水解蛋白质、多糖和脂质的主要细菌[28]。
1.2 影响EBPR系统功能微生物的因素在研究EBPR系统功能微生物时，聚磷菌和聚糖菌是关注的焦点。之前的观点普遍认为PAOs与GAOs之间存在竞争关系[29]；而最近有文献报道，在以亚硝酸盐为电子受体同时去除硝酸盐和正磷酸盐的过程中，PAOs与GAOs表现出良好的合作关系[30]。EBPR系统中主要功能微生物(PAOs和GAOs)的种类及其丰度受到很多因素的影响。
1.2.1 碳源碳源是影响EBPR系统中功能微生物的重要因素，常见的碳源种类有葡萄糖[31]、乙酸[32]、丙酸[33]等。除了单一种类碳源外，不同比例的混合碳源也受到一些研究者的关注[34]。姜涛[35]研究表明，以乙酸钠和丙酸钠作为碳源时，PAOs对二者的吸收速率基本相同，而GAOs对乙酸钠的吸收速率要远高于对丙酸钠的吸收速率。采用葡萄糖作为碳源时，厌氧区也存在糖原的合成，导致PAOs继续利用糖原进行后续酵解，从而降低EBPR系统的稳定性。张兰河等[36]在连续流的A2/O反应器中考察不同碳源对PAOs和GAOs种类和丰度的影响，结果发现采用葡萄糖作为碳源时，GAOs富集最多，PAOs数量较少，说明葡萄糖不利于PAOs生长。采用乙酸和丙酸作为碳源时，分别获得最多的PAOs和最少的GAOs，聚磷菌更容易成为优势种。
1.2.2 pHEBPR系统的性能受到外部pH的强烈影响，这是因为不同的酸碱条件下微生物的群落结构及相关功能微生物的活性存在很大差异。Zhang等[37]对于EBPR相关的特定酶活性进行研究发现，在pH 6.4-7.6的范围内，较高的pH值有利于PAOs的生长和提高其活性，从而提高除磷性能。Ahn等[38]研究了实验室规模的EBPR系统中，在稳定条件下不同pH值对微生物群落组成的长期影响。他们发现，当pH值从7.5降到7.0，再降到6.5的过程中，PAOs﹕GAOs平衡发生变化，PAOs在代谢过程中表现的越来越像GAOs。他们进而认为，EBPA性能的降低不一定是系统中微生物群落结构发生了变化，而是由于原来功能微生物代谢方式的转变。Fukushima等[39]在3个实验室规模的反应器中研究了pH降低对PAOs和GAOs的影响，结果表明pH降低对Accumulibacter数量下降具有即时或延迟的影响。同时，Accumulibacter数量下降与EBPR系统性能开始下降之间也存在时间延迟，这意味着pH降低导致EBPR系统性能降低的原理还需要进一步探索。
1.2.3 温度原水和外部环境的温度是影响EBPR系统微生物群落和功能微生物代谢特征的又一重要因素。微生物的活性、生化反应的速率都受到温度的影响，之前普遍的观点认为较低的温度可能使功能微生物活性降低，代谢速率减慢，导致EBPR系统的除磷效率下降。Erdal等[40]在实验室对5℃条件下失效的EBPR系统进行了深入的酶学研究，结果表明系统除磷性能的下降可能不是GAOs增殖的结果，而是PAOs的代谢途径存在向GAOs等non-PAOs转换的可能，导致PAOs体内储存更多的糖原而不是poly-P。关于温度对影响EBPR系统中微生物的机理还没有完全明确，有待进一步研究。
1.2.4 外源污染物近几年来，外源污染物对EBPR系统中微生物群落结构尤其是功能微生物的影响越来越受到研究者们的关注。Hu等[41]评估了红霉素(ERY)和土霉素(OTC)在短期(24 h)内对EBPR系统的影响，分别考察了个体效应和组合效应。结果表明，10 mg/L的ERY和OTC可以抑制功能微生物的活性，但24 h内不会引起严重的功能微生物死亡；由于OTC对革兰氏阴性细菌具有特殊的抗性，而PAOs大多属于这类细菌，所以OTC比ERY对于EBPR系统具有更强烈的负面影响。该团队还采用高通量测序方法研究了ZnO纳米颗粒(NPs)对EBPR系统中微生物群落的影响，结果表明，在高浓度(高于6 mg/L)的ZnO NPs条件下，EBPR体系的物种丰富度降低。暴露于2 mg/L ZnO NPs之中，Competibacter比Accumulibacter更容易受其影响。将EBPR系统恢复20 d后，发现反应器中微生物群落转变是不可逆的[42]。Sun等[43]研究了Ni(Ⅱ)在0.1-10 mg/L范围内对EBPR的短期和长期影响，微生物群落调查显示，长期接触Ni(Ⅱ)后，α-变形菌纲的GAOs代替PAOs成为EBPR系统中主要的微生物。
2 高效聚磷菌获取 2.1 高效聚磷菌的筛选和分离从污水处理厂EBPR系统的活性污泥中筛选和分离出具有聚磷功能的微生物是目前应用最广泛的获得高效聚磷菌的方法。
2.1.1 传统分离方法传统筛选和分离高效聚磷菌方法：利用不同培养基将微生物从污泥或污水等环境样品中分离纯化，在缺磷培养基中饥饿放磷之后投加到富磷培养基中计算除磷效率，从而筛选出高效PAOs。周明璟等[44]通过厌氧/好氧交替的平板筛选方法得到15株除磷率高于60%的高效PAOs，包括13株γ-变形菌纲菌株和2株芽孢杆菌；投加菌株后可将活性污泥的除磷率由原来的52%提高到73.3%。庄志刚等[45]以排污口污泥为原始材料，采用传统微生物筛选方法，分离得到一株高效PAOs，通过分子生物学鉴定为产碱杆菌(Alcaligenes)；该菌株可以耐受浓度45 g/mL以内的磷。朱卫强等[46]利用同样的方法从污水处理厂的活性污泥中获得两株假单胞菌属的DPAOs，它们在经过驯化后能有效去除高盐度废水中的氮磷。
自然条件下，环境样品中PAOs通常不是优势种，为了提高筛菌的效率，有研究者采用先富集后分离的方法获得高效聚磷菌。李慧等[47]先用SBR反应器对活性污泥进行富集驯化，之后从中筛选得到3株高效PAOs，通过分子生物学鉴定为气单胞菌属(Aeromonas)。刘彩云等[48]以污水处理厂成熟的活性污泥为菌种来源，在富集培养基中循环7个周期之后，结合经典微生物筛选方法，获得一株脱氮除磷效率超过90%的假单胞菌。
2.1.2 蓝白斑筛选2003年，Morohoshi等[49]发现phoU基因突变可导致大肠杆菌中多聚磷酸盐的积累，在N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)诱变后，在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯(X-P-i)的琼脂平板上，phoU突变体可以很容易地被筛选出来，由此开发了“蓝白斑”筛选法。他们运用这种方法获得两株高效PAOs，恶臭假单胞菌MY11和不动杆菌K3，在磷含量9 mg/L的合成培养基中除磷效率接近90%。
随后，在高效PAOs的筛选中蓝白斑筛选法得到越来越多的应用。蔡天明等[50]采用蓝白斑筛选，结合传统方法，从土壤中获得一株弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)GM1；在MOPS培养基中好氧培养24 h后，GM1可将初始浓度为43.8 mg/L的磷去除69%。该团队采用相同的方法分离获得另一株高效PAOs恶臭假单胞菌GM6；采用SBR工艺处理磷含量约9 mg/L的医院废水，加入该菌株20 d后出水磷浓度约0.3 mg/L，去除率达96.8%[51]。张丹丹等[52]采用蓝白斑筛选法从污水处理厂活性污泥中分离出两株高效PAOs，其中一株与植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)的同源性为98%，一株与克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)的同源性为98%。
2.2 高效聚磷菌的构建除了直接通过筛选和分离得到的野生型高效PAOs外，还可以在深入了解poly-P代谢相关基因和酶的基础上，使用基因工程手段人工构建高效聚磷工程菌。近年来，越来越多的研究集中在聚磷工程菌的聚磷机制[53]。多聚磷酸盐激酶(Polyphosphate kinase，PPK)是在PAOs聚磷过程中合成poly-P的关键酶，在宿主细胞中过表达PPK基因是构建高效聚磷工程菌的途径。
王勤等[54]克隆大肠杆菌聚磷激酶，定向转入到受体菌株大肠杆菌BL21(DE3) 中，得到可过表达PPK的基因工程菌BL-PPK；在IPTG的诱导下，BL-PPK菌能大量合成poly-P，其细胞内含量比对照菌高20倍，培养液中磷酸盐浓度约为对照菌培养液中磷酸盐浓度的1/9。杜宏伟等[55]将携带大肠杆菌PPK基因的重组质粒pUTmini-Tn5-PPK整合进入恶臭假单胞菌KT2440中，获得基因工程菌KT2440-PPK，人工模拟污水实验结果表明，KT2440-PPK可以去除该模拟污水中90%以上的磷酸盐。
3 结语综上所述，对EBPR系统中的微生物学研究已经取得一定的进展，研究发现的PAOs和GAOs以及其他辅助细菌的种类越来越多。除传统碳源、pH、温度等因素外，外源污染物(如抗生素和重金属)对于EBPR系统中微生物组成的影响逐渐受到关注。为了获得高效PAOs，传统分离方法、蓝白斑筛选法、人工构建工程菌的方法先后得到应用。但是，PAOs在特定条件下是否能够表现出GAOs的代谢特性这一问题还存在争论。现代分子生物学技术的发展将为EBPR系统中功能微生物的研究提供先进可靠的技术手段[56-57]。笔者认为，未来的研究将围绕以下几个方面展开。
3.1 深入研究代谢机理了解EBPR系统中主要功能微生物的代谢机理是研究EBPR系统中PAOs和GAOs种群数量动态变化的基础。未来的研究将应用聚合酶链式反应(PCR)、16s rRNA测序、荧光标记原位杂交(FISH)等一系列现代分子生物学技术，从底物吸收机制、糖酵解途径、三羧酸循环等几个方面深入研究EBPR系统中微生物的代谢多样性和特异性。进一步研究PAOs与GAOs在不同环境条件下的代谢模型，判断它们的竞争、合作和转化关系，掌握系统中主要功能微生物的种群结构动态变化过程。
3.2 探索获取高效聚磷菌的新方法传统分离方法和蓝白斑筛选法过程比较繁琐、得到的功能微生物种类较少，人工构建的工程菌效果还不够稳定[58]。因此，为了简单、快速获得高效PAOs，需要不断改进创新分离和筛选方法。例如，在探明菌株代谢和聚磷机理的基础上，添加特定显色剂、改良培养基配方、合理使用富营养培养基和寡营养培养基，直接根据菌落形态和颜色挑选出PAOs。同时，鉴于人工构建的工程菌质粒易丢失、对环境的适应能力较差等现状，为PPK基因寻找合适的载体和宿主细菌，构建结构稳定、聚磷效率高的工程菌是目前重要的研究方向。
3.3 高效聚磷菌应用于实际污水目前，研究者普遍使用人工模拟废水验证高效PAOs的除磷效果，但是将其应用于实际污水中除磷的研究却少见报道。实际污水化学成分和微生物群落结构复杂，基于人工模拟废水的研究成果很难准确指导EBPR系统的实际运行。一方面，选择在实际污水中能够成为优势种群的宿主细菌；另一方面，使用实际污水验证高效PAOs的除磷效果。总之，应用基因工程技术获得能够在污水中生长除磷的高效聚磷工程菌，优化运行条件为体系中功能微生物提供适合的生长环境是未来研究的主要趋势之一。
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