随着石油、煤炭等非可再生资源的逐渐枯竭，可再生能源的开发利用已经成为人们迫切的需要。生物质乙醇被广泛认为是洁净、安全的可再生资源，是化石燃料的替代品^[1]。商业化的生物质乙醇主要是以蔗糖和淀粉为原料，但是将蔗糖和淀粉应用于生物质生产将会和人类食物产生竞争^[2]。因此，基于生物质转化的纤维素乙醇因其原料的可再生和低成本的特点，成为众多学者研究的对象。目前，微生物转化利用生物质主要存在两个方面的难点：(1)由于木质纤维素结构的致密性和复杂性，必须对原料进行预处理从而提高后续水解的效率和单糖的释放。在预处理过程中高温、高压的化学条件会导致一系列有毒物质的产生，这些有毒物质会对细胞的生长、代谢以及乙醇的产量产生明显的抑制作用^{[3, 4]}。(2)木质纤维素由半纤维素、纤维素和木质素组成，其中木糖由半纤维素水解得到，约占木质纤维素水解液中单糖含量的30%^{[5, 6]}，因而微生物需要具备能够同时有效地转化五碳糖、六碳糖为乙醇的能力^[7]。

酿酒酵母作为传统的生产乙醇的菌株，具有乙醇产率高、葡萄糖消耗速度快、鲁棒性较高等优点。近年来，研究者将细菌或真菌中的木糖代谢路径导入酿酒酵母^{[8, 9]}，在增强酵母菌对抑制剂耐受性^[10]上取得了一系列成就，本文将围绕酿酒酵母在生物质转化利用方面的工程化进行阐述。

1 增强酿酒酵母抑制剂耐受性的研究进展

随着对细胞的耐受机理的解析，相关的基因改造策略和合理的基因线路已经被成功设计来强化菌株对单一抑制剂的耐受性，传统的随机突变与筛选在强化酿酒酵母抑制剂耐受性方面发挥着重要的作用，同时对酿酒酵母的全局调控方面的研究也越来越深入。

1.1 精确基因工程改造 1.1.1 基因工程改造提高对糠醛的耐受性

抑制剂中的糠醛能够诱导酿酒酵母细胞内活性氧的积累，从而损伤细胞线粒体和液泡膜、肌动蛋白细胞骨架和和核染色质等^[11]。MSN2是酿酒酵母细胞中自我精细表达应激转录调控基因，赵鲜仙等^[12]通过构建在ADH7启动子控制下表达MSN2，增强了菌株对糠醛耐受能力，又避免了其持续高效表达带来的副作用。谷胱甘肽可以改变由糠醛引起的过氧化状态。Gorsich过表达谷胱甘肽合成路径的基因 GSH1 和GLR1 增强胞内的谷胱甘肽水平或者外源添加谷胱甘肽只能提高细胞对糠醛的耐受能力^[13]。

1.1.2 基因工程改造提高对乙酸的耐受性

水解液中的弱酸类抑制剂主要与解偶联合细胞内阴离子积累有关，细胞质酸化抑制细胞内代谢活动，细胞在膜上ATP 酶的协助下将H⁺泵出细胞，大量ATP的消耗导致细胞内能量供应不足，对细胞的生长和众多代谢过程产生影响，进而导致细胞质的酸化^[14]。目前的研究主要从降低乙酸的吸收，增强氢离子和乙酸离子的外排，以及增强乙酸在胞内的代谢等方面着手。Tenreiro^[15]过表达基因AZR1，该蛋白通过阻碍乙酸的吸收或者升高胞内的pH值来增强细胞耐受乙酸的能力。在酿酒酵母中过表达基因ACS2，从而增强细胞以乙酸为前体合成乙酰辅酶A的能力，增强乙酸的代谢，增强了细胞在乙酸条件下的生长速率，缩短了延滞期的时间^[16]。王昕^[17]将γ-氨基丁酸反转运蛋白GadC在酿酒酵母中表达，建立不依赖于 ATP的新的质子泵。

1.1.3 基因工程改造提高对酚类物质的耐受性

有研究指出酚类物质可能作用于细胞膜，破坏细胞膜的完整性以及线粒体膜的电化学梯度，从而影响细胞膜的选择透过能力^[18]。然而，由于酚类物质种类繁多，对其毒性机制缺乏深入研究，因此通过基因改造提高酿酒酵母对酚类物质耐受性的研究也相对较少。漆酶被证明可以有效降低水解液中多种酚类物质的含量，提高后期的发酵效率^[19]。Larsson等^[20]将白腐真菌Trametes versicolor 中的漆酶基因在PGK1启动子的控制下于酿酒酵母中异源表达，成功提高了酿酒酵母对酚类抑制剂松柏醛的耐受性。

1.2 随机突变与筛选

由于细胞代谢网络和调控网络的复杂性，很多基因在细胞的中作用机制以及作用靶点尚未清楚，为了优化功能模块与细胞的适配性从而提高目标性状，目前很大程度上依赖于基因随机突变策略。利用易错PCR、紫外或化学诱变等方法构建基因的随机突变库，结合压力筛选，进而定向筛选出理想的性状。Alper^[21]利用易错PCR技术对酿酒酵母细胞内源的转录因子Spt15p进行多轮改组突变修饰，筛选到的突变菌株spt15-300对乙醇的耐受性明显提升。董健等^[22]以AY12为出发菌株，进行紫外突变获得酿酒酵母突变群体，再与酿酒酵母反复产孢与杂交筛选得到基因组重排最优的菌株LYQ-F1。郭天琦等^[23]对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC 20618经DES诱变后获得耐高温和抑制剂的乙醇菌株D24。

1.3 全局调控策略

由于生物体系的复杂性，尤其是压力耐受性这一复杂性状，单一的研究某一组分的变化无法详细阐述与生物特定行为相关的内外扰动因素，因此基于细胞生理状态平衡的全局调控策略。ASK等^[24]人通过过表达谷胱甘肽合成路径相关基因 GSH1、CYS3和GLR1增强细胞内谷胱甘肽的合成，改变细胞内的氧化还原状态，从而增强了酿酒酵母在利用预处理的云杉木为原料进行的同步糖化发酵过程中抗逆性。王昕^[17]将源于耐辐射球菌的IrrE基因进行密码子序列优化，在酿酒酵母中异源表达，通过易错PCR筛选，得到耐受性能进一步提升的酵母菌株。刘红梅等^[25]利用gTME方法构建共发酵木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母菌株，能够很好的利用木糖和葡萄糖。

2 优化酿酒酵母中木糖代谢途径的进展

酿酒酵母的木糖利用是纤维素乙醇工业化生产的一个限制因素，木糖是木质纤维素原料中含量次高的单糖，充分利用木质纤维素水解产物木糖，能使乙醇产量提高25%左右^[26]，对纤维素乙醇工业化生产有着重要的意义。然而，野生的酿酒酵母菌株不能利用木糖生产乙醇，因此，在现有的木糖利用酿酒酵母菌株中，引入自然界天然存在的外源木糖代谢路径^[27]，然而经过改造后的酿酒酵母仍然存在因XR和XDH辅因子偏好性不同，造成副产物木糖醇积累，发酵效率低下的问题^[27]。另外，酿酒酵母缺少特定的木糖转运蛋白，需依赖葡萄糖转运蛋白，葡萄糖对木糖利用的抑制^[28]。

2.1 改变辅因子偏好基因工程改造

酿酒酵母中木糖利用途径XR-XDH中，因XR对辅因子NADPH的亲和力要远远高于NADH的亲和力，而XHD以NAD+作为转型辅酶，造成辅因子不平衡，导致木糖醇的积累，降低发酵效率^[28]。通过对XR/XDH途径中蛋白的辅因子偏好性进行改造。主要策略是通过对XR/ADH进行理性或者随机的突变改变其辅因子偏好性或者引入外源的缓解辅因子不平衡的辅酶。Sadat等^[27]通过对酿酒酵母中的XR进行定点突变将其辅因子偏好性变成严格的NADPH使XDH的辅因子偏好性变成严格的NADP+，使木糖醇的积累减少34.4%-54.7%。Bro^[28]通过引入NADP+依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶^[29]，Zhang引入水合NADP氧化酶来调节胞内辅因子不平衡。

2.2 缓解葡萄糖对木糖的抑制作用的基因工程改造

在酿酒酵母中细胞对糖的代谢，跨膜运输是糖代谢途径中的第一步。葡萄糖和木糖共发酵时，酵母因缺少专一性的戊糖转运蛋白，因此在葡萄糖戊糖共发酵时，戊糖利用会被葡萄糖完全抑制，降低发酵效率^[30]。研究主要集中在发现并获得专一性高的戊糖转运蛋白酶，用来缓解或解除葡萄糖对于戊糖的抑制^[31]。Subtil^[32]揭示了在木糖与葡萄糖共发酵时，木糖的摄取是最大的限速步骤，因此通过过表达外源的戊糖转运蛋白Hxt7和Gal2可以缓解葡萄糖对于木糖的抑制作用。

2.3 基因组重排技术

基因组重排把传统的突变和重组结合起来，一般通过循环重组的方法获得目标性状提升的基因型，可以加速有益表型的积累^[33]。基因组重排可以通过原生质体融合和杂交进行。杂合子菌株会继承亲本菌株木糖利用或耐受抑制剂的优点。Inoue^[34]和 Kim^[35]在性状相反的酿酒酵母菌株中导入XR-XDH-XK基因通路，再通过杂交获得木糖利用的杂合子细胞，杂合菌株在木糖利用上有很大提升，证实了酿酒酵母有性杂交是传统但是有效的方法。曹萌等^[36]利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Y5)和木糖发酵酵母(Pichia stipites CBS6054)为亲本进行灭火原生质体融合，构建出了发酵抑制剂的酵母菌株Y10-F.提升了菌株的耐受性。

3 酿酒酵母菌株过程强化

用于酿酒酵母菌株过程强化主要是进化工程和优化功能模块与底盘细胞的适配性。目标基因或外源模块导入宿主细胞后，在一定程度上使得菌株的特性有所增强，但要实现目标性状的最优化，通常需要进行功能模块和底盘细胞间的适配性调节。Kim^[37]通过过优化GRE3和XYL2，XYL3的表达强度缓解在酿酒酵母在限氧条件下的氧化还原不平衡的问题。另外，常采用的一个适配策略是通过调节功能模块中启动子强度或者质粒拷贝数控制目标基因在细胞中的表达量，使得目标基因对于细胞来说处于一个适当的表达强度。Zhao等^[38]对酿酒酵母细胞中常用的14个启动子强度进行了表征，同时酿酒酵母具有已商业化的不同拷贝数的载体质粒，这些为调节基因在酿酒酵母中的表达强度提供了很好的理论依据。进化工程是利用细胞自身的适应进化能力获得目标性状，Narayanan^[39]对TMB3500在低pH和纤维素水解液中经过短期驯化，驯化后的菌株可以在有氧的条件下生长和无氧的条件下发酵，在pH3.7的条件下展现出了优秀的脱毒机制^[39]。

为了强化酿酒酵母菌株，通常会把理性设计和进化工程结合起来。Zha等^[40]设计、构建了由木糖还原酶基因XYL1、木糖醇脱氢酶突变体基因mXYL2和木酮糖激酶基因XKS1构成的木糖代谢模块，初步获得可以实现五六碳糖(主要是葡萄糖和木糖)共利用发酵的基因工程酿酒酵母。通过进一步优化XYL1和mXYL2的表达、强化非氧化磷酸戊糖途径功能，优化木糖代谢模块和酵母底盘细胞间的适配性，进一步获得了木糖代谢速率达到0.260 g/L/h、乙醇得率为0.20 g/g的酵母菌株SyBE004。为了获得更高效的五六碳糖共利用菌株，Zha等^[41]在 SyBE004的基础上，基于传代限氧培养的进化工程改造，获得了进化菌株SyBE005。与SyBE004相比，SyBE005的木糖代谢速率和乙醇产率提高2.20倍、2.67倍，乙醇得率提高到0.33 g/g。

4 结语

随着对细胞的耐受机理的解析，相关的基因改造策略和合理的基因线路已经被成功设计来强化菌株对单一抑制剂(纤维素水解中的3种代表性抑制剂：糠醛、乙酸、苯酚)的耐受性。一般强化酿酒酵母对抑制剂的耐受性需要结合定向基因工程改造、随机突变与进化工程。但是针对单一抑制剂的基因工程改造，仍然存在很大的局限性。通过木糖利用途径中改变辅因子偏好基因工程改造，可以在一定程度上强化酿酒酵母木糖利用能力，提高木糖利用效率。但是木糖/葡萄糖同步糖化共发酵，缓解葡萄糖对木糖利用抑制方面仍然是一个瓶颈问题。

工程菌株的性能提升一直是生物质转化研究的核心内容，理性设计构建和随机建库筛选两种策略将持续推进生物质转化菌株的性能提升。在理性设计构建方面，随着组学技术的提升和数据的积累，我们对菌株的代谢特征和耐受特性的理解越加深刻，可以不断挖掘新的代谢瓶颈以提升代谢性能，获得新的耐受靶点和通路，强化菌株的耐受能力。此外，将菌株的代谢能力提升和耐受能力强化进行耦合也是一种非常有潜力的菌株性能提升策略。另外，随着近年基因组编辑技术的发展，可以实现基因组的多位点编辑，也为菌株的性能提升提供了新的可能。在随机建库筛选方面，新的基因组重排技术的出现，尤其是基于基因组合成的重排技术，可以实现更大范围的菌株随机建库，补充组学技术无法挖掘到的工程菌基因型与表型之间的关系，进一步推动菌株性能的提升。在工程强化方面，微流控技术的结合或将在传质和反应加速方面提升生物质转化的效率，具有很好的前景。