2. 南方医科大学基础医学院神经生物学教研室，广州 510515;
3. 南方医院放疗科，广州 510515
2. Department of Neurobiology，School of Basic Medical Science，Southern Medical University，Guangzhou 510515;
3. Department of Radiation Oncology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515
核糖开关(riboswitch)作为一种新型基因调控方式，打破了之前人们对于基因调控的认识，它可以不通过蛋白质来调控基因表达。核糖开关作为一种RNA元件，与参与体内代谢的小分子化合物如核酸、氨基酸、金属离子、糖类衍生物以及辅酶结合，通过构象改变对mRNA转录、翻译、剪切过程进行调控，从而调节相应基因的表达。
近年来有越来越多的核糖开关在微生物体内被发现，但是至今未在一种真核生物细胞中发现一种核糖开关，研究者基于核糖开关的这些特性，致力于将核糖开关应用于研究新型抗菌药物。因为目前由于抗生素的滥用，细菌耐药性越来越严重，细菌感染的疾病的治疗也越来越棘手，所以研制针对细菌新靶点的新型抗菌药是一个刻不容缓的任务。
1 核糖开关 1.1 核糖开关的发现2002年，Winkler等[1]发现在大肠杆菌(Esch-erichia coli)中维生素B12转运蛋白(btuB)mRNA的5'-非编码区存在高度保守的序列，称为“B12 box”，它可直接结合维生素B12的辅酶5'-脱氧腺苷钴胺素(5'-deoxyadenosylcobalamin，Ado-Cbl)，使其空间结构发生改变，从而调节btuB基因的活性。后来将这类可以调控基因表达的RNA序列被命名为“核糖开关”。核糖开关是一类可以与小分子配体结合的RNA元件，与配体结合后可以通过调控相应下游的基因表达起到控制细胞生命及活动的作用。核糖开关一般位于mRNA的5'非编码区(UTR)，部分位于3' UTR或编码区内，通过顺式作用调控基因表达[2]。
1.2 核糖开关的构成核糖开关主要由两部分组成，适配子(aptamer)和表达平台(expression platform)。适配子序列高度保守，能够特异性与配体结合后使其下游的表达平台发生构象变化，从而调控下游基因的表达，包括对mRNA剪切、转录终止、翻译起始等过程的调控[3, 4]。核糖开关一个显著的特点是与适配子结合的配体不是蛋白质，而是一些小分子化合物，如维生素、嘌呤及其衍生物、蛋白辅酶及其相关的化合 物、氨基酸和被磷酸化的糖类，如葡萄糖胺-6-磷酸[5]、tRNA和某些金属离子[6]等，最近几年还发现了对温度敏感的适配子[7]。
1.3 核糖开关的作用机制 1.3.1 转录终止型在mRNA从5'到3'方向，分别有抗抗终止子(anti-anti-terminator)序列、抗终止子(anti-terminator)序列和终止子(terminator)序列。5'端先转录出的抗终止子序列先和部分终止子碱基形成茎环结构，使得终止子无法形成茎环结构，终止信号无法形成，转录可以继续进行，生成完整的mRNA分子。当有效浓度的特异性配体分子结合到适配子上时，使得抗抗终止子和抗终止子序列形成茎环结构，而终止子序列与下游多聚U形成终止信号，使得转录提前终止，生成短链无效mRNA[11]。
1.3.2 翻译抑制型在起始密码子上游有一段SD序列，是核糖体结合的位点(RBS)，其上游从5'到3'分别还有抗抗SD序列和抗SD序列，正常情况下抗抗SD序列和抗SD序列结合，使得核糖体结合到SD序列上，开始翻译。当存在有效浓度的配体时，配体与适配子结合，使得SD序列与抗SD序列结合，使得核糖体无法结合上去，翻译无法开始。
1.3.3 核糖核酶型这一类核糖开关有核酶的性质。正常情况下，核酶性质不表达。当配体与适配子结合后，核糖开关的核酶活性被激活，使得mRNA自我剪切，暴露5'端未磷酸化的位点，被RNA水解酶降解[12]。
1.4 核糖开关的筛选 1.4.1 体外筛选最先应用体外筛选得到的是glmS核糖开关。在glmS核糖开关被激活时会被切割的序列两端分别标记Cy3和FAM染料，Cy3作为荧光受体，FAM作为荧光供体，当两者同时存在于序列两端时检测不到荧光；而当配体与glmS核糖开关结合后，glmS核酶活性被激活，序列被裂解，从而能检测到荧光。此方法可用于检测各种化合物对glmS核糖开关的亲和力[13]。
体外筛选还可通过体外固定某个配体，来筛选与之结合的适配子。可通过配体指数级富集系统进化技术(systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX)筛选得到结合相应配体的核糖开关[14, 15]。最近You等[16]在体外构建一种Spinach核糖开关，通过与配体结合可以显示出Spinach荧光，配体与适配子的亲和力与荧光的强弱呈正相关。将Spinach插入TPP核糖开关，构建成Spinach-TPP核糖开关，将TPP类似物结合上去，分析荧光结果与已知这些类似物的亲和力一致。
1.4.2 体内筛选体外筛选技术虽然能较为精确地筛选到配体化合物或者核糖开关的适配子序列，但由于体内外条件不同，体外筛选得到的结果不一定适用于细胞内，所以有必要研究核糖开关的体内筛选技术。Watson等[17]将从枯草芽孢杆菌中提取出的glmS核糖开关插入绿色荧光蛋白(GFP)的5'端非编码区，再将这个融合基因插入到酵母菌PGK1基因的3'非编码区，在半乳糖诱导型启动子的作用下进行表达。在含有半乳糖或者甘油的培养基中，酵母菌表达出绿色荧光，而在含葡萄糖的培养基中，glmS核糖开关因有配体结合，所以检测不到绿色荧光蛋白的表达。通过这一方法可实现在体内筛选核糖开关的体外合成的配体化合物。
1.5 核糖开关的应用基于核糖开关的作用特点和在微生物体内的重要作用，现有研究将核糖开关应用在工业新型抗菌药物的研发、工程菌株的筛选[18]以及构建新型生物传感器[19]等方面。
核糖开关可以作为抗菌药研究的新靶点的优势如下：(1)目前发现的核糖开关主要存在于原核生物体内，没有在哺乳动物细胞内发现核糖开关，所以针对核糖开关的抗菌药物对人体来说是安全的，副作用较小；(2)核糖开关调控的基因通常是编码细菌生存或致病必需的基因，以其为靶点的抗生素应具有强力的杀菌作用；(3)核糖开关的结构现在研究得较为清楚，且配体大部分是一些小分子化合物，研究者可以根据药物研发的需要进行核糖开关的改造。
2 几类重要的核糖开关作为抗菌药物的新靶点 2.1 嘌呤核糖开关嘌呤核糖开关包括鸟嘌呤(guanine)核糖开关、腺嘌呤(adenine)核糖开关和2'-脱氧鸟苷酸(2'-deoxyguanosine)核糖开关。由于嘌呤合成是细菌繁殖的必需过程，所以嘌呤核糖开关作为抗菌药物作用的靶点将有较强的抗菌作用。Kim等[8]利用从枯草芽孢杆菌中提取出的鸟嘌呤核糖开关在体外合成并筛选有高亲和力的配体。他们发现其中一个鸟嘌呤类似物(6-N-hydroxylaminopurine 或 G7)，可以抑制鸟嘌呤核糖开关下游的报告基因的表达，揭示出它可能作为抑制细菌繁殖的化学分子。Ster等[20]证明一种鸟嘌呤类似物2，5，6-三氨基嘧啶-4-酮[2，5，6-triaminopyrimidine-4-one(PC1)]可通过结合鸟嘌呤核糖开关抑制guaA基因编码GMP合成酶。在金黄色葡萄球菌感染而患有乳腺炎的牛体内注射不同剂量的PC1，对照组注射相同剂量的生理盐水，观察PC1的杀菌作用。结果显示实验组的杀菌效果为15%，对照组为0。为了研究PC1可能带来的副作用，研究者还将PC1注射到健康牛的乳房中，结果发现奶牛泌乳状况和其他生理状况没有明显改变，说明PC1的使用安全性。这为耐药细菌的治疗提供了新思路[21]。
2.2 赖氨酸核糖开关赖氨酸核糖开关位于lysC和lysP基因的mRNA的5'端非编码区[22]，lysC基因编码天冬氨酸激酶，该酶是赖氨酸合成初始阶段的关键酶，lysP基因编码赖氨酸通透酶。目前发现的赖氨酸类似物有4种：L-氨乙基半胱氨酸(AEC)、L-3-[(2-氨乙基)-磺酰基]-丙氨酸(L-3-[(2-Aminoethyl)-sulfonyl]-alanine)、L-4-氧代赖氨酸(L-4-oxalysine)、Dl-反式-2，6-二氨基-4-己烯酸(Dl-trans-2，6-diamino-4-hex-enoic acid)。这些化合物与赖氨酸有相似的亲和力可结合到赖氨酸核糖开关的适配子区域。后3种化合物在应用6 h后，其抑制细菌数量是空白对照组的5倍；24 h后抑菌数量甚至达到100%。但也有研究发现AEC同时参与哺乳动物细胞和细菌细胞的代谢途径，所以应用AEC可能会对人体造成毒性[23]。
2.3 c-di-GMP核糖开关环二鸟苷酸(c-di-GMP)是一种第二信使分子，接受细胞受体第一信使分子传递的信号，再调控下游生物分子从而发挥效应。c-di-GMP可调控多种生物功能，如调控细菌黏附、生物膜的形成、细菌毒力的产生等[24]。目前发现c-di-GMP主要存在于原核生物细胞内，真核细胞中只在一种原虫细胞中发现，这一特性极大地提高了c-di-GMP运用的安全性。
c-di-GMP核糖开关根据作用机制可分为两类。第一类是由Sudarsan等[25]证实c-di-GMP核糖开关通过结合c-di-GMP抑制mRNA翻译起始，继而抑制下游基因的表达。如在艰难梭菌中，c-di-GMP核糖开关调控鞭毛蛋白的表达，当c-di-GMP与之结合后，抑制鞭毛蛋白的合成，从而抑制了细菌的运动[26]；第二类是作为变构剪切酶，当c-di-GMP与适配子结合后，mRNA进行自我剪切修饰，形成外显子，暴露出核糖体结合位点，从而促进蛋白质的合成[24]。
Furukawa等[27]研究了线性c-di-GMP在核糖开关中的活性。在对于β-半乳糖苷酶的表达测定实验中，线性c-di-GMP与c-di-GMP核糖开关有较高的亲和力，并且对β-半乳糖苷酶的表达发挥强烈的调控作用。但在没有c-di-GMP核糖开关的突变菌株内也观察到相似的表达谱，说明线性c-di-GMP的效应途径的不专一，它不仅与c-di-GMP核糖开关结合，还与其他物质结合发挥效应。
最近在苏云金芽孢杆菌BMB171菌株中发现了一种被称为Bc2 RNA的c-di-GMP核糖开关。通过与c-di-GMP结合形成反终止的序列，使得所调控的下游胶原黏附蛋白基因继续表达，这是一种“ON”型核糖开关[28]。如果根据这一特点研发出c-di-GMP的拮抗物，将会是减弱细菌的繁殖和感染的重要研究进展。
2.4 glmS核糖开关glmS核糖开关广泛存在于革兰氏阳性菌中，位于编码6-磷酸葡糖胺(GlcN6P)合成酶基因的上游5'端非编码区。GlcN6p是细菌细胞壁成分N-乙酰葡糖胺的前体物质，所以glmS核糖开关对于细菌的生存至关重要。同时glmS核糖开关也是一种核酶，当GlcN6P与核糖开关结合后，核酶活性被激活，从而使基因的mRNA可进行自我剪切[29]。
目前已发现的体外GlcN6P类似物有carba-GlcN6P，该化合物在杀灭金黄色葡萄球菌方面有良好的效果。在与glmS核糖开关结合方面，carba-GlcN6P与GlcN6P有相似的亲和力，并且在下调GlcN6P合成酶表达的效果上，carba-GlcN6P与GlcN6P的差异也不显著。与空白对照组相比，carba-GlcN6P能使细菌量减少3倍，并且glmS基因的表达也降低了2倍。所以对于多重耐药的金黄色葡萄球菌，carba-GlcN6P是一个极具应用前景的药物[30]。目前此种药物已经申请药物专利(美国专利号20140066409 A1，2014年)[23]。
2.5 TPP核糖开关硫胺素焦磷酸(Thiamine pyrophosphate，TPP)是一种维生素B1(硫胺素)的衍生物，参与多种糖和氨基酸的代谢[23]。TPP核糖开关位于编码TPP的合成和转运的mRNA的上游，当TPP与其结合，可通过抑制转录、抑制翻译起始、剪切mRNA的方式抑制相应基因的表达[31]。
第一个被证实有抗菌作用的TPP类似物是吡啶硫胺(pyrithiamine，PT)，2005年，Sudarsan等[32]证实了PT通过与TPP核糖开关结合的抗菌作用。在含有PT的培养基中分别培养枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌，可以观测到与TPP核糖开关耦联的lacZ报告基因表达下调，此结果为TPP核糖开关作为抗菌靶点的研究奠定基础。
2.6 FMN核糖开关在细胞中，核黄素(riboflavin)(维生素B2)通过核黄素激酶的作用生成黄素单核苷酸(flavinmononucleotide，FMN)，FMN再通过FAD合成酶生成黄素腺嘌呤二核甘酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)。FMN和FAD都是细胞代谢中重要的辅酶，参与氧化还原反应、催化脱氢、氧化和电子转移或羟基化过程，在呼吸等生物氧化过程的电子传递中具有重要作用。FMN核糖开关位于核黄素合成和转运基因的非编码区，当与配体结合，相应mRNA上的SD序列构象发生变化[33]，使得核黄素的生成和转运受到抑制。
自然界中存在一种核黄素类似物是由链霉菌合成的玫瑰黄色素(roseoflavin)。2009年Ott[33]和Lee[34]相继通过实验证实roseoflavin可以与枯草芽孢杆菌中的FMN核糖开关结合，并下调FMN核糖开关的lacZ报告基因的表达。细胞表面存在roseoflavin转运蛋白，能将roseoflavin转运至细胞内。当roseoflavin进入细胞后，经历与核黄素类似的生物转化过程，相继转化为RoFMN、RoFAD。2013年Langer等[35]发现在含有高浓度的roseoflavin培养基中培养大肠埃希菌，黄素蛋白过度表达，黄素蛋白结合RoFMN或RoFAD变成异常黄素蛋白。因为这些蛋白与FMN或FAD结合的黄素蛋白有差别，活性可能会有所下调，所以会导致细菌某些生理功能表达缺陷，从而达到抑菌的效果。体外实验中也发现，兔肝脏中的5-磷酸吡哆胺氧化酶、猪肾脏中的氨基酸氧化酶活性都有所下降。上述结果表明，FMN核糖开关可以作为抗菌药物研究的新靶点。
最新研究发现另一种FMN类似物——ribocil，其最大亮点在于这是第一种完全体外合成的作用于FMN核糖开关的化合物。Ribocil中央的羟基嘧啶哌啶核心是与适配子结合的必要条件。Ribocil通过结合到FMN核糖开关上起到抑菌的作用，并在大肠杆菌感染致败血症的小鼠模型实验中显示出较好的抗菌活性[36]。目前已有机构正在致力于将riboci研发为新型抗菌药。
3 前景与展望核糖开关作为一种新型调控基因表达的方式已经被发现10多年，它通过结合小分子配体，使得靶向RNA构象发生变化，再通过抑制转录或翻译进而实现抑制相应基因的表达。如果能研究出针对细菌的核糖开关的化合物，作用于细菌重要的生理活动中，下调细菌生存所必需的物质合成就能起到抑菌杀菌作用。
尽管核糖开关有很多可以作为抗菌药物作用靶点的优点，可是现在存在很多限制：一是需要在体外合成这些核糖开关配体的类似物；二是这些类似物必须要进入细菌的代谢途径，与核糖开关有较高的亲和力；三是这些类似物进入人体后是否也能发挥抗菌的作用？因为这些限制，以核糖开关作为抗菌素作用靶点的研究大都还停留在体外实验阶段，只有鸟嘌呤类似物PC1已进行动物实验，所以核糖开关还有很大的研究空间。但基于核糖开关的特性和优势，相信不久的将来核糖开关类药物会作为新生代抗菌药为患者带来福祉。
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