近年来，肠道细菌与糖尿病的关系日渐被人关注，随着第2代高通量测序技术的普及，对在糖尿病状态下，肠道细菌群落结构的变化的研究已成为主流。本文将一些基于高通量测序技术对糖尿病与肠道菌群相关性的研究进行了综合分析，讨论宿主在糖尿病及治疗状态下其肠道菌群的组成和多样性，旨在为预防和治疗糖尿病提供新的思路。

1 高通量测序技术

高通量测序技术是现代生命科学研究的核心技术之一，它实现了同时对几百万 DNA 分子测序的可能性，达到鉴定微生物的单一基因或全基因组的目的^[1]。目前第2代高通量测序平台主要有Roche公司的454焦磷酸测序平台，Illumina公司的Hiseq和Miseq测序平台，以及ABI公司的Solid 4测序平台。

宏基因组（Metagenome）技术是指不经过微生物培养阶段，直接提取环境中总DNA，对微生物基因总和进行研究的技术。在研究肠道细菌时采用宏基因组技术，可以了解胃肠道微生物区系组成、进化历程和代谢特点，挖掘具有应用潜力的新基因^[2]。宏基因组技术主要包括16S rRNA和全基因组两种测序技术。16S rRNA测序技术的基本流程是在提取肠道细菌基因组后，利用PCR技术扩增16S rRNA片段，通过高通量测序平台测定出扩增产物的序列，分析出各序列所代表的细菌，从而对肠道细菌进行分类学鉴定和精确定量。细菌16S rRNA基因具有保守区与可变区间隔排列的特征，其中可变区具有菌种特异性，同时可以反映细菌间亲缘关系的远近，因此通过分析可变区的序列即可得到各细菌的分类学特征^[3]。16S rRNA技术的缺点是无法提供肠道中未培养微生物的遗传、代谢和生理生化等方面的信息，而直接将肠道中全部微生物基因组提取出进行测序的全基因组测序技术则可以弥补这一不足。

2 肠道菌群的种类与分布

肠道内微生物种类繁多，其中厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroides）为优势菌门，其次是放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）等。在不同肠段，肠道菌群的分布不同，十二指肠有10¹ - 10³ CFU/mL数量级的细菌，小肠的空肠段细菌浓度一般为10³ - 10⁴ CFU/mL，回肠末端细菌浓度为10⁷ - 10⁹CFU/mL，且多为革兰阴性菌。而在结肠段，细菌的数量远远多于小肠，有10¹¹ - 10¹²CFU /mL数量级的细菌，这主要是因为结肠内环境呈中性或弱碱性，且内容物移动较为缓慢而导致细菌大量繁殖^[4]。结肠细菌主要以厚壁菌门和拟杆菌门等专性厌氧菌为主^[5]。

3 糖尿病状态下宿主肠道菌群的差异 3.1 1型糖尿病（T1DM）与肠道菌群

T1DM是一种器官特异性的自身免疫疾病，以胰岛β细胞的特异性破坏，胰岛素绝对缺乏为主要发病基础。T1DM的发病机制十分复杂，目前认为其与遗传、免疫、环境等因素有关^[6]。Alkanani等^[7]运用高通量测序技术测定后发现自身抗体阳性的T1DM患者，体内的拟杆菌属细菌的丰度升高，普雷沃氏菌属（Prevotella）细菌的丰度下降。T1DM患儿的肠道菌群分布也是失衡的，某些菌群如放线菌门/厚壁菌门、厚壁菌门/拟杆菌门的比例降低，一些有益菌群如产生丁酸盐的细菌含量减少^[8]，这些结果说明T1DM患者的肠道菌群与正常人相比存在一定的差异。Wirth等^[9]用DNA测序分析发现，在T1DM大鼠的回肠段，菌群的丰富性和多样性有着较大的改变，在胰岛素治疗后，肠道菌群的组成发生了特异性重排，他们的研究还提示，在T1DM大鼠肠道菌群的研究中，回肠段比结肠段和粪便更值得被关注，变形菌门细菌可以成为诊断和治疗的重点，而变形菌门的克雷伯氏菌属（Klebsiella）更可被认为是T1DM的生物学标志之一。Patterson等^[10]用高通量16S rRNA测序技术研究SD大鼠肠道菌群的组成，数据显示，在注射STZ制造T1DM大鼠模型的5周内，厚壁菌门/拟杆菌门的比例随着T1DM的进展发生着变化。在属的水平，乳酸菌如乳酸杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）的数量在T1DM后期显著增加。

3.2 2型糖尿病（T2DM）与肠道菌群

目前，依靠肠道菌群组成的差异可以判断患者是否患有T2DM，此方法改变了单纯依靠血糖的判断方式，同时可以得到患者肠道菌群具体的、微小的差别，为后续的治疗奠定了基础。Qin^[11]对345例中国人的肠道细菌进行两阶段宏基因组关联分析，确定了约 60 000个与T2DM相关的分子标记，从分子层面上明确了中国T2DM患者与非糖尿病患者在肠道细菌组成上差异。T2DM患者伴随着中度肠道细菌菌群失调，产生丁酸的细菌丰度下降，各种条件致病菌数量增加。而肠道细菌产生的丁酸，对维持健康的肠道菌群，辅助治疗T2DM起着重要的作用^[12]。Larsen等^[13]采用454焦磷酸测序技术进行了测序，发现T2DM患者的肠道内拟杆菌门与厚壁菌门的数量均明显低于正常人，且二者的比例与血糖浓度成正比。此外，T2DM患者中 β-变 形菌（Betaproteobacteria）有大量富集现象，其含量随着血糖浓度的升高而增加。

在T2DM早期进程中，肥胖和胰岛素抵抗已经引起了肠道菌群的改变，肠道菌群组成的差异可作为高危患者T2DM发病的早期诊断标志物。Zhang等^[14]根据121名受试者的糖耐量情况将其分成了正常组，糖尿病前期组和新诊断的T2DM患者组，用基于16S rRNA的高通量测序技术对受试者的肠道菌群进行了测定，发现疣微菌科细菌Akkermansia muciniphila ATCCBAA-835和梭菌科细菌Faecalibacterium prausnitzii L 2-6 等产生丁酸的细菌在正常组较糖尿病前期组有更高的丰度。在属的水平上，T2DM患者组体内的拟杆菌属细菌的丰度只有其它两组的一半。同时发现，疣微菌纲细菌在糖尿病前期组和T2DM组具有显著的低丰度，可能是T2DM的潜在标记物。

3.3 妊娠糖尿病（GDM）与肠道菌群

虽然GDM患者糖代谢多数于产后能恢复正常，但将来患T2DM机会会增加，且GDM患者若不及时治疗，流产的风险会显著增加，Fugmann 等^[15]对GDM患者的肠道菌群16S rRNA进行高通量测序后发现，GDM组患者体内拟杆菌门的普雷沃氏菌（Prevotellaceae）丰度显著升高，厚壁菌门细菌丰度显著下降。因此，肠道菌群组成的差异可辅助用于GDM的筛查。最新的研究发现，新生儿的胎粪的菌群组成也可以预测母亲妊娠前的糖尿病状态，在GDM患者所产下的新生儿的胎粪中，拟杆菌门细菌和吉氏副拟杆菌属（Parabacteriodes）细菌数量显著增加^[16]。综上，不同类型的糖尿病对宿主肠道菌群结构的影响，见表 1。

4 改善糖尿病状态下宿主肠道菌群结构的治疗方式 4.1 食物

食物是肠道菌群构成的决定因素之一。Di Luccia 等^[17]用16S rRNA测序方法来评估大鼠肠道细菌的组成，发现果糖丰富的饮食会诱导代谢综合征的发生，同时粪球菌属（Coprococcus）和瘤胃球菌属（Ruminococcus）细菌的丰度升高，提示肠道菌群与代谢综合征的发生发展具有相关性。因此，从控制和调整饮食的角度来改变肠道菌群从而调节糖尿病的发生发展，仍然是目前科研的主流方向。

Hansen 等^[18]用不同饮食喂养有GDM的NOD小鼠发现，饲喂无麸质饮食小鼠产下的幼鼠其肠道菌群中疣微菌科、变形菌门（Proteobacteria）细菌的数量明显增多，T1DM的发病率降低。Marietta等^[19]的研究发现，饲喂无麸质饮食的NOD小鼠其肠道菌群中双歧杆菌、拟杆菌门紫单胞菌科细菌Tannerella和Barnesiella的数量显著降低，疣微菌科细菌数量显著增多。同时发现，在麸质饲料中加入蛋清或酪蛋白，能显著降低NOD小鼠的血糖。这些研究均提示早期生活干预会改变肠道菌群环境，从而降低T1DM的发病率。

增加膳食纤维的摄入可通过改变肠道菌群而改善T2DM。Kim等^[20]对素食1个月的6名T2DM伴高血压患者研究发现，其体重降低，甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、糖化血红蛋白、空腹血糖和餐后血糖水平均有所改善。同时用454焦磷酸测序方法检测素食者肠道细菌的16S rRNA，发现厚壁菌门/拟杆菌门的比例降低，γ-变 形菌纲的肠杆菌（Enterobacteriaceae）数量下降，共生菌如脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）和梭状芽胞杆菌（Clostridium）数量增加，从而导致肠道内载脂蛋白和短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）水平也随之下降。

4.2 药物

阿卡波糖是治疗T2DM的较为成熟的药物，在降低血糖的同时，阿卡波糖能通过增加肠道双歧杆菌的数量，降低炎性细胞因子的含量而治疗T2DM^[21]。Shin等^[22]用454焦磷酸技术对小鼠的肠道菌群进行了测序，发现二甲双胍能通过增加肠道疣微菌科细菌的数量而调节肠道菌群。因此对于传统的降血糖药物，高通量测序技术给予了一个全新的视角去阐释其作用功效。

中药治疗糖尿病的作用机理也可以通过其对肠道菌群的作用进行相关研究。Xu 等^[23]对187例T2DM患者进行了双盲实验，用454焦磷酸测序技术对患者肠道菌群16S rRNA基因的V3区进行了检测，发现我国传统中药方剂葛根芩连汤能显著提高肠道有益细菌如普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）的数量，且该细菌的水平被证实与空腹血糖、餐后2 h血糖和糖化血红蛋白水平呈负相关，因此葛根芩连汤可以通过改善肠道菌群的结构而治疗T2DM。Zhang等^[24]用高通量测序技术对高脂饮食大鼠进行了检测，发现小檗碱治疗组大鼠肠道菌群的多样性显著降低。一些促进产生SCFA的细菌选择性富集，SCFA对于维持肠道的正常功能和结肠上皮细胞的形态和功能具有重要作用，因此小檗碱可以部分改善肠道菌群的结构，从而控制高脂饮食喂养大鼠的肥胖和胰岛素抵抗。

此外，科学家还发现了一些植物提取物能通过改善肠道细菌菌群结构而防止T2DM的发生。Anhe 等^[25]发现蔓越橘提取物富含多酚，能增加小鼠肠道菌群中疣微菌科细菌的数量而改善代谢综合征。葡萄多酚可通过显著增加疣微菌科细菌数量，降低厚壁菌门/拟杆菌门的比例而改善肠道细菌群落结构，防止饮食引起的肥胖和代谢性疾病^[26]。Schogor等^[27]对反刍动物的瘤胃细菌的16S rRNA进行了检测，发现以普雷沃菌属为主的11种细菌能将亚麻木酚素代谢为强抗氧化剂，从而治疗心血管疾病，骨质疏松症和糖尿病等多种疾病。

4.3 益生元

服用益生菌（Probiotics）或益生元（Prebiotics）是目前较为关注的改善肠道微环境的方法。对于益生菌，研究得较多的是双歧杆菌和乳杆菌，但目前应用的水平还存有许多不足，如细菌在肠道中的定植力，细菌在通过上消化道时是否会被破坏掉，细菌在肠道的滞留时间以及益生菌产品的时效等。益生元是一种功能性低聚糖，由 2-1 0个相同或不同的单糖以糖苷键聚合而成，可直接替代糖类作为配料加入到食品中^[28]。益生元对肠道微生态环境的改善是把肠道菌群作为了一个整体，肠道菌群共同作用对益生元产生发酵，发酵产生的SCFA剌激双歧杆菌和乳杆菌等有益菌增长，从而起到调节肠道细菌环境的目的。

Everard等^[29]对T2DM的遗传（ob/ob）小鼠长期饲喂含益生元的饮食，然后用高通量测序技术对其肠道菌群的16S rRNA进行了检测，发现小鼠体内厚壁菌门细菌减少，拟杆菌门细菌增加，102个不同类群的细菌也随之改变。同时发现益生元可以通过调节肠道菌群而改善T2DM小鼠的糖耐量，降低脂肪含量，提高瘦素敏感性。Dewulf等^[30]对30例肥胖妇女给予3个月的ITF益生元（即菊粉﹕低聚果糖=1﹕1）和安慰剂的双盲实验，然后用高通量测序技术对其粪便中肠道菌群的16S rRNA进行了检测，发现服用ITF益生元的患者双歧杆菌和普拉梭菌的细菌数量增加，且与血清内毒素水平呈负相关。ITF益生元也可降低拟杆菌属和丙酸杆菌属（Propionibacterium）细菌的数量，同时降低脂肪含量，血浆乳酸和磷脂酰胆碱的水平。这样的结果提示益生元能引起肠道菌群的改变从而对肥胖和/或糖尿病产生有益的影响。

4.4 粪便菌群移植

在现代医学中，使用粪便菌群移植治疗疾病可追溯到1958年，美国外科医生对4名患有严重伪膜性肠炎的患者实施了粪便菌群移植。粪便菌群移植是原理是将维持了健康供者功能的肠道菌群移植给受者，并最终在受者肠道内重建适合受者的功能菌群，粪便菌群移植现在被认为是抗生素治疗无效之后的最后防线^[31]。在治疗糖尿病方面，Brown 等^[32]在非肥胖糖尿病（NOD）和耐药（NOR）小鼠之间进行相互的粪便菌群移植发现，NOD小鼠的粪便菌群移植到NOR小鼠的体内会导致NOR小鼠发生胰岛素抵抗。而若将健康男性的粪便菌群移植到患有代谢综合征的男性患者体内，会显著提高后者的胰岛素敏感性，增加其肠道菌群的多样性^[33]。虽然目前科学家对粪便菌群移植治疗糖尿病的原理知之甚少，但有了高通量测序技术作为手段，相信最终会为研究粪便菌群移植治疗糖尿病铺平道路。

5 过度使用抗生素对糖尿病状态下宿主肠道菌群结构的影响

众所周知，抗生素的过度使用会抑制肠道内有益菌的生长，导致肠道菌群失调。现在的研究表明，抗生素的过度使用有可能会通过损伤肠道菌群而导致糖尿病的发生。Candon 等^[34]分别在不同的生长阶段灌胃混合的广谱抗生素（链霉素、多粘菌素和氨苄青霉素）和万古霉素给予NOD小鼠，发现两种给药方案中雄性NOD小鼠T1DM发病率均显著增加，通过对小鼠肠道菌群16S rRNA的V3区进行检测发现，混合抗生素组的肠道菌群几乎全部消失，万古霉素组埃希氏菌属（Escherichia）、乳杆菌属和伯克氏菌目Sutterella细菌丰度增加，毛螺旋菌（Lachnospiraceae）、普雷沃氏菌等细菌丰度降低。这些结果提示万古霉素等抗生素会通过损伤肠道菌群而增加雄性NOD小鼠T1DM的发病率。

6 展望

肠道菌群结构的改变与糖尿病的发生发展密切相关。通过高通量测序技术能更深入的研究肠道菌群的数量和种类，同时还可以通过功能基因比对深入了解细菌在代谢等方面的特征。对目前的研究尚存在一些有待进一步发掘的问题，如宿主的遗传因素对糖尿病的发病至关重要，但目前从肠道菌群的角度去考虑的相关研究还很少；一些国外的研究提到用窄谱抗生素可通过肠道菌群干预治疗糖尿病，但用什么抗生素，针对的是什么菌群，治疗程度如何，目前的研究还很少。同时，高通量测序技术本身还存在一些问题，如罕见菌的数据库资料不完善；没有国际公认的使用规则及测序结果解释标准；PCR扩增时可能会出现碱基错配、基因突变、基因缺失等情况，在一定程度上影响了16S rRNA基因序列分析的准确性^[35]。

但是，相信随着高通量测序技术的不断进步和完善，它必然会在通过肠道菌群而预防和治疗糖尿病中发挥更重要的作用。