动物体中70% - 80 % 干重是蛋白质,氨基酸作为蛋白质合成的底物原料,是维持动物基本生理功能所必需的营养物质,并参与到动物体内多个生命活动中。此外,氨基酸还能通过自身或其代谢产物的生物活性,调节营养物质代谢并为机体提供能量,最终影响动物体的生长发育[1]。自噬是一种在真核生物中广泛存在的并依赖于溶酶体降解的途径,在细胞的存活、更新和细胞内环境稳定中都发挥重要作用。mTOR是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,并在调节细胞自噬过程中起到关键作用,mTORC1和mTORC2是细胞内mTOR存在的两种功能不同的复合体。近年来许多研究表明,氨基酸缺乏能通过作用于mTORC1信号通路来诱导细胞自噬[2]。miRNA是一类通过与靶基因mRNA的3′UTR 6-8 nt结合来抑制其翻译或降解其靶基因,从而调节靶基因表达的非编码RNA,最近研究证实miRNA参与到调控氨基酸缺乏诱导的细胞自噬[3]。本文综述了不同氨基酸缺乏对细胞自噬的影响及其调控机制,并进一步探讨了miRNA在氨基酸缺乏诱导的自噬中发挥的重要作用。以期为氨基酸或miRNA治疗自噬相关代谢疾病提供新途径和思路。
1 细胞自噬概述细胞自噬(autophagy)是指在一些特定环境下(如饥饿、缺血缺氧及生长因子缺乏等),细胞中的溶酶体融合形成自噬溶酶体并通过吞噬自身细胞质蛋白或细胞器以完成本身代谢和某些细胞器更新的过程。根据底物进入溶酶体进行降解途径的不同,细胞自噬可分为三种:(1)大自噬或巨自噬( macroautophagy):指内质网来源的膜包绕待降解物形成自噬体,然后与溶酶体融合并降解其内容物;(2)小自噬或微自噬(microautophagy):溶酶体或者液泡内膜直接内陷将底物包裹并降解的过程;(3)分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA):指胞质内蛋白结合分子伴侣后被转运到溶酶体中,然后被溶酶体酶消化的过程。目前对于自噬的研究主要集中在大自噬,它主要包括自噬泡的发生、自噬体的形成、自噬体的运输融合、自噬体的降解四个阶段[4, 5]。细胞自噬受到内部环境和外部应激作用的共同影响,并且与生物体的生长、发育和疾病等的发生密切相关,自噬的发生及其调控机制目前已成为生命科学研究的热点之一。
2 必需氨基酸与细胞自噬必需氨基酸是指机体自身不能合成或合成速度不能满足需要,必须从食物中摄取的氨基酸。必需氨基酸缺乏能诱导细胞自噬的发生,但在不同细胞中作用机制不尽相同。目前研究者对亮氨酸、精氨酸、蛋氨酸以及生酮氨基酸诱导细胞自噬做了相关研究。
亮氨酸是蛋白质合成底物,在蛋白质周转、调节和能量代谢等方面都具有重要的生物学功能。在多个细胞株中的实验证实亮氨酸是调节mTO RC1的关键氨基酸,当亮氨酸的浓度降低时,也会影响其他氨基酸对mTORC1的调节作用[6]。亮氨酸缺乏时C2C12成肌细胞通过抑制mTORC1通路来诱导自噬发生并激活溶酶体依赖的蛋白水解作用[7]。最近在对293T和U2OS细胞的研究中发现,亮氨酸缺乏导致的自噬是通过对BARKOR/ATG14起作用从而激活mTORC1而发生的[8]。但亮氨酸缺乏在黑色素瘤细胞中却有不同的研究结果:Sheen等[9]用亮氨酸缺乏处理黑色素瘤细胞后发现RAS-MEK通路被激活而不能有效降低mTORC1的活性,因此阻断了mTORC1诱导的细胞自噬,而亮氨酸缺乏最终诱导了黑色素瘤细胞发生caspase依赖的凋亡作用,说明在不同细胞中氨基酸缺乏可能会导致不一样的作用效果。
精氨酸是动物体蛋白合成的必需氨基酸,同时也是多种生物活性物质的合成前体。精氨酸也是细胞重要信使物质一氧化氮(NO)的合成前体物,而NO作为一种普遍存在的信号分子广泛参与到了细胞的许多生物功能中。Angcajas等[10]发现总氨基酸和单个氨基酸的缺失都能明显导致肝癌细胞的自噬发生,用雷帕霉素处理后精氨酸缺失诱导的自噬作用不能降低,接下来的研究发现精氨酸缺乏诱导能调控NO的活性,NO能抑制亚硝基化底物c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK1),进而抑制 VPS34-Beclin1复合体的形成来影响细胞自噬,这可能是氨基酸缺乏诱导自噬的新途径。前列腺癌细胞中精氨酸缺乏能导致线粒体功能障碍和染色质自噬等非典型自噬现象,还能引起细胞发生氧应激和DNA损害,并且与ATG5和BECN1等相关自噬基因的表达相关[11, 12]。
生酮氨基酸包括亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸5 种氨基酸,已有报道在食物中添加生酮氨基酸能治疗脂肪肝。Xu等[13]研究发现饲喂生酮氨基酸后能明显激活小鼠肝脏中AMPK活性并降低mTORC1的磷酸化作用,说明生酮氨基酸能减少小鼠肝脏中自噬的发生。
蛋氨酸也是参与蛋白质合成的必需氨基酸,与生物体内各种含硫化合物的代谢密切相关。Laxman[14]的研究证实蛋氨酸和其代谢产物 S-腺 苷甲硫胺酸充足时,Ppm1能催化蛋白磷酸酶PP2A发生甲基化,使得Npr2不能发生磷酸化而丧失活性,Npr2是诱导非氮自噬的蛋白体复合物(Iml1-Npr2-Npr3)中的关键蛋白,当蛋白体复合物(Iml1-Npr2-Npr3)激活时则能抑制mTORC1活性,从而促进细胞自噬。
氨基酸缺乏大部分是通过调节自噬相关蛋白或调控 mTORC1依赖的自噬通路,从而诱导细胞自噬。不同氨基酸在同类细胞或同种氨基酸在不同细胞中诱导自噬的程度及机制有很大区别,因此开展氨基酸缺乏自噬对细胞的研究,对更好了解细胞的生理生化功能、预防疾病等有着重要的指导意义。
3 谷氨酰胺在细胞自噬中的作用谷氨酰胺是细胞快速生长和分化的重要供能物质,也是蛋白质代谢的重要调节因子,研究报道在多种细胞中谷氨酰胺的缺失都能导致一定程度的细胞自噬,但也有报道认为谷氨酰胺代谢过程中释放的NH3通过诱导细胞自噬mTORC1通路从而刺激自噬[15-17]。Nicklin等[18]发现 L-谷 氨酰胺和必需氨基酸在调节mTORC1和细胞自噬中起到截然不同的作用,其中细胞对 L-谷 氨酰胺的摄入是必需氨基酸和生长因子激活mTORC1的关键步骤。Chen等[19]发现细胞通过调控氨基酸摄入来调节自噬的新机制:在谷氨酰胺饥饿的细胞中发现GAAC通路被激活和ATF4表达上调,从而诱导氨基酸转运蛋白SLC7A5的表达上调并且增加氨基酸的摄入和细胞内氨基酸水平,随后激活mTORC1通路并抑制自噬的发生。在胚胎成纤维细胞中,atg5敲除细胞与谷氨酰胺缺乏的野生型细胞在许多生理代谢功能方面都类似,并且谷氨酰胺诱导的自噬对维持细胞线粒体氧化磷酸化和对细胞生长发育起到重要作用[20]。总之,谷氨酰胺既可以刺激细胞自噬,但在某些情况下谷氨酰胺饥饿也能导致细胞自噬,这可能和研究的细胞株或谷氨酰胺处理的时间与浓度有关。
4 氨基酸缺乏诱导细胞自噬机制 4.1 氨基酸缺乏与细胞自噬mTOR是自噬的关键调节点,是生长因子存在和营养丰富的情况下关闭自噬的主要抑制信号通路,广泛参与细胞生长、增殖、自噬以及代谢调控等生物学功能,它与其他一些蛋白质形成雷帕霉素敏感型mTOR复合体1(mTORC1)和非雷帕霉素敏感型mTOR复合体2(mTORC2)[21]。目前已知细胞在氨基酸缺乏发生的自噬水平变化主要依赖于mTORC1[22]。
当细胞外可利用的氨基酸有限时,细胞可以通过自噬作用消化自身细胞器或大分子成分获得能量以维持生存[23]。研究者认为氨基酸是通过作用于细胞表面的G蛋白偶联受体TAS1R1-TAS1R3来激活细胞内mTORC1而抑制细胞自噬的发生,该受体可活化磷脂酶C(PLCβ)和上调细胞内Ca2+浓度来激活MAPK1/3,从而激活 mTORC1[24, 25]。Ghislat等[26]研究表明小鼠胚胎细胞中总氨基酸的缺乏增加了细胞质中Ca2+浓度,并激活Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)依赖的AMPK信号通路,腺苷酸活化的蛋白激酶AMPK是细胞中感受能量状态调节代谢的一个蛋白激酶,在自噬发生的调控中也发挥着重要的作用。AMPK的激活能使mTORC1活性下降,并使mTORC1与ULK1分离,ULK1能发生自身磷酸化而促进自噬起始复合物ULK 1-Atg13-FIP200的形成,并诱发细胞发生自噬。Kim等[27]报道在神经元细胞中总氨基酸缺乏能同时诱导自噬和凋亡,但在敲除了关键自噬基因BECN1的神经元细胞中自噬现象被抑制但神经元对促凋亡信号却更敏感,说明自噬本身能够对细胞起到一定的保护作用。总之,氨基酸缺乏能下调mTORC1通路因子表达,上调关键自噬蛋白,从而诱导细胞自噬。
4.2 miRNA在氨基酸缺乏诱导细胞自噬过程中的作用机制miRNA是一类长度为1 8-2 4 nt的非编码核苷酸,广泛存在于各种生物体中,几乎在所有的生理和病理过程(包括生物个体发育、器官形成、细胞增殖、细胞自噬与凋亡等)中都发挥着重要的调控作用。成熟的miRNA通过碱基互补配对与靶基因3′UTR区域结合降解靶基因mRNA或抑制其翻译来调控其表达水平[28]。细胞自噬是一个复杂的动态作用,其过程受到多个自噬相关基因或信号通路的调节作用,miRNA可通过调控细胞自噬相关基因的表达,影响组蛋白修饰,从而影响细胞自噬的发生[29]。
近年来的研究表明,氨基酸缺乏诱导的细胞自噬过程受到miRNA的调节(表 1)。Wu等[30]发现亮氨酸缺乏在诱导小鼠成肌细胞自噬的同时,miR-17家族中的两个miRNA:miR-20a和miR-106b的表达下调显著,进一步研究发现miR-20a和miR-106b的靶基因是unc-51 样激酶1(ULK1),ULK1是自噬关键蛋白ATG1在哺乳动物中的同源蛋白,在自噬体的形成中是必需的,研究表明miR-20a和miR-106b主要是通过上调ULK1的表达来促进自噬的发生。Korkmaz等[31, 32]发现在MCF-7和Huh7细胞中miR-376a和miR-376b的过表达都能抑制氨基酸缺乏而导致的细胞自噬。报道称miR-376a和miR-376b的靶基因是ATG4C和BECN1,BECN1能直接影响自噬典型通路的激活而ATG4C对自噬的强度密切相关,实验证实miR-376a和miR-376b能通过靶向自噬相关基因ATG4C和BECN1而抑制其转录和蛋白水平从而抑制细胞自噬。Dubinsky等[33]发现氨基酸缺乏的情况下能引发原代神经元细胞的自噬,并且miRNA let-7在其中起到关键作用,let-7的过表达能抑制氨基酸应答通路中3个重要的蛋白Map4k3、RagC和RagA的表达,从而抑制氨基酸依赖的mTORC1通路来促进神经元细胞的自噬,此外,研究者还发现在肌肉和脂肪细胞上,抑制let-7的表达能使自噬水平下调,说明let-7可能于体内平衡和自噬通路的控制上也起到关键作用。还有研究表明细胞营养缺乏时mTORC1能调节miRNA的合成:DROSHA是加工pri-miRNA到前体miRNA(pre-miRNA)的关键核糖核酸酶,Mdm2作为DROSHA的泛素连接酶3并能直接泛素化DROSHA并诱导其降解,氨基酸缺乏时mTORC1活性下降,mTORC1能影响Mdm2的表达,进而调控DROSHA的活性来影响细胞中miRNA的生成[34]。在氨基酸缺乏时miRNA既可以通过调控自噬相关蛋白参与细胞自噬的发生,同时mTORC1通路相关蛋白还能影响成熟miRNA的合成和加工,但目前对于miRNA参与调节氨基酸缺乏诱导的细胞自噬过程的相关报道并不多,具体机制尚不明确,需要进行深入探索。
5 结语基于上述研究,氨基酸缺乏能诱导细胞自噬,并且大部分是通过mTORC1依赖的自噬通路从而调控细胞自噬,但不同氨基酸在同类细胞或同种氨基酸在不同细胞中表现出的自噬调控程度,以及分子机制有明显区别,这可能和细胞类型以及氨基酸的种类相关。同时一些特定的miRNA能够直接或间接地参与氨基酸缺乏诱导的细胞自噬,但目前与此相关报道较少,且涉及到的分子调控机制尚不明确,需要进一步阐明。因此在今后的工作中,综合应用各种研究方法和技术深入探寻不同氨基酸对细胞自噬发生的调控机制,同时探明miRNA在此过程中发挥的关键作用,以及miRNA对应的相关靶基因的分子调节机制,探寻氨基酸诱导自噬的分子调控机制以及探明miRNA在此过程中发挥的关键作用,为利用氨基酸或miRNA治疗人类代谢生理疾病提供新的途径与思路。
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