2. 东北农业大学动物科技学院,哈尔滨 150030;
3. 中国农业科学院饲料研究所基因工程室,北京 100081
2. Institute of Animal Nutrition,Northeast Agricultural University,Harbin 150030;
3. Gene Engineering Laboratory,Feed Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081
防御素(defensin)是一类高度稳定、富含半胱氨酸(Cys)在宿主防御系统中起重要作用的内源性抗菌肽[1],存在于真菌,植物和动物等组织[2],分子量约 2-6 kD,含较多正电荷氨基酸残基,多由 6-8 个保守Cys残基形成 3-4 对二硫键[3],因其具有效抵御细菌[4]、真菌[5, 6]及病毒[7-9]等高效广谱抗菌功能和免疫调理作用备受关注。二硫键是防御素的共有重要结构和功能基团对防御素分子抗菌功能、正确折叠和空间结构稳定起重要作用。据报道用二硫苏糖醇 DTT还原人防御素HBD3中的二硫键会导致其三级结构被破坏[10]。缺一对二硫键的人防御素HBD1的三级结构不稳定,在水溶液中呈无规则卷曲状态[11]。故揭示二硫键和防御素之间的定向构效关系及其突变体对病原菌及恶性肿瘤细胞等病原体的杀伤机制[12, 13]一直是该领域关注热点。此外,具有高活性的单二硫键和线型肽突变体对简化生产流程、减少成本至关重要。因此,本文就防御素功能、结构,二硫键突变方式、突变体对其结构与功能影响作一综述,对该领域研究和发展方向作出展望。
1 防御素来源及结构 1.1 防御素分类依据防御素来源可以将其分为5大类,分别为:哺乳动物源、植物源、无脊椎动物源、类防御素及其他防御素[14],根据分子内半胱氨酸的位置和连接方式又可将哺乳动物防御素分为 α-防御素、 β-防御素和 θ-防御素[15]。
1.2 防御素二硫键分子特征α-防御素的成熟肽由2 9-3 6个氨基酸组成,6个保守Cys残基组成3个分子内二硫键,连接方式为Cys1-Cys6,Cys2-Cys4,Cys3-Cys5; β-防御素由3 8-4 2个氨基酸残基组成,3对分子内二硫键连接方式为 Cys1-Cys5,Cys2-Cys4,Cys3-Cys6; θ-防御素含有18个氨基酸残基,3对分子内二硫键 Cys1-Cys6,Cys2-Cys5,Cys3-Cys4 连接成环形结构[16];成熟的昆虫防御素大多由3 8-4 2个氨基酸组成,6个半胱氨酸残基组成3对二硫键,其连接方式为Cys1-Cys4,Cys2- Cys5,Cys3-Cys6,这种连接方式与真菌防御素Plectasin的二硫键连接方式相同;植物防御素由4 5-5 4个氨基酸残基组成,一般含4对二硫键,其二硫键连接方式为Cys1-Cys8,Cys2-Cys5,Cys3-Cys6,Cys4-Cys7[17]。
1.3 防御素的结构与功能防御素一级结构可分为结构残基和功能残基。结构残基与高级结构的稳定性紧密相关,这类氨基酸残基高度保守。功能残基主要包括带电荷、疏水性氨基酸残基,由此决定防御素的抗菌功能、盐离子敏感性[18]。例如,防御素中Cys序列高度保守,由此决定pH和热稳定性[19]。禽类防御素AvBD2在-20至100℃和pH 3 -1 2范围内能保持显著抑金黄色葡萄球菌活性[20]。
防御素二级结构多含一个 α-螺旋结构和一对反向平行的 β-折叠片层结构及位于其间起连接作用的Loop区。其中 α-螺旋结构具两亲性,即其两面分别为亲水性残基面和疏水性残基面,该结构有助于防御素分子与靶生物细胞膜接触并作用[21]。 β-折叠结构区域则富含带有正电荷的氨基酸残基[22]。Loop区的构象和柔韧性对防御素的抗菌功能具有决定性作用[23]。大多数防御素都含具有两亲性的 α-螺旋或富含正电荷的 β-折叠,这两种结构特征有利于与微生物细胞膜互作,两亲性结构和较多净电荷数都是防御素实现抗菌功能的必备条件[24]。
防御素三级结构包含一个典型的CSαβ结构,即二硫键稳定的 α-螺旋和 β-折叠结构[25]。防御素四级结构就是其单体间二聚所形成的二聚体。四级结构可使防御素电荷表面和疏水表面的结构发生变化,进而影响抗菌功能[26]。
2 二硫键对防御素活性的影响在多项国家基金与科研计划资助下,本小组对含有3对二硫键的首例真菌防御素Plectasin及其衍生肽进行一系列研究。在毕赤酵母中实现Plectasin[27]及NZ2114[28]的高效分泌表达,产量分别达748和2 390 mg/L,质谱验证Plectasin及NZ2114具有完整3对二硫键,一级结构与理论相符,所建立生产体系达到产业化生产水平,有效降低抗菌肽生产成本。在此基础上,对NZ2114进行改造,设计其衍生肽MP1102[29],产量为695 mg/L,质谱验证完整形成3对二硫键,对临床分离Staphylococcus aureus最低抑菌浓度(MIC)为0.0 4-0 .23 μmol/L,活性较NZ2114显著增强,进一步拓宽抗MRSA候备药物选用范围。
为进一步评价二硫键对防御素抗菌功能的影响,本小组Yang等[30]用二甲基亚砜(DMSO)氧化或用DTT还原Plectasin发现,氧化型Plectasin与氧化前抑菌圈大小一致,而被DTT还原1 h后的Plecta-sin抑菌圈远小于还原前和氧化型Plectasin的抑菌圈。Cao等[31]用DMSO氧化和用DTT还原MP1106发现,10%和20% DMSO处理后,MP1106对S. aureus ATCC25923的抑菌圈与对照无明显改变,但经5 mmol/L 和10 mmol/L DTT还原处理的MP1106活性比对照减弱(直径13 mm对15 mm),说明DTT对重组MP1106活性有轻微影响。王少然等[16]用丙氨酸替代Plectasin中Cys,并检测突变体对S. aureus ATCC 25923抑菌活性发现,7个突变体均有抗S. aureus活性,其中突变体C4/30A、C19/39A、C4/19/30/39A和C15/19/37/39A抗性最强,相比Plectasin略微降低;突变体all C→A抑菌活性次之;突变体C15/37A和C4/15/30/37A对 S. aureus的抑菌活性基本丧失。经Garnier 软件预测 Plectasin及其二硫键突变体二级结构表明(C19/39A)Plectasin、(C4/19/30/39A)Plectasin、(C15/19/37/39A)Plectasin、(all C→A)Plectasin 等4个突变体的螺旋度增加,其中(all C→A)Plectasin螺旋度是Plectasin两倍;除(C15/19/37/39A)Plectasin外,其余突变体折叠有所上升;随着二硫键增多转角比例明显降低,所有突变体的无规则卷曲有所下降。
然而,二硫键对防御素抗菌功能的作用影响机制尚未完全阐明。对某些防御素改变其氧化还原状态或二硫键连接方式并不影响其抗菌功能[22, 32]。但另外也有一些报道说明二硫键对某些防御素的抗菌功能来说是必需的[30, 33]。目前研究二硫键对防御素功能的影响主要有以下几种方式:(1)氧化还原:如使用还原剂DTT或氧化剂DMSO处理防御素分子,打开或连接分子内二硫键,测定抗菌活性的变化[30, 31];(2)半胱氨酸替代:用丙氨酸(Ala)或丝氨酸(Ser)替代防御素序列中Cys使其不能形成二硫键[34, 35];(3)二硫键连接方式重排:改变防御素分子中二硫键天然连接方式,观察抗菌活性的变化[22, 36]。
2.1 二硫键的氧化还原对防御素抗菌功能的影响Schroeder等[33]发现,加入还原剂DTT,人 β-防御素-1(hBD-1)能抑制G+菌Bifidobacterium adolescentis生长,抑制圈大小和程度随DTT浓度而增大,不加DTT对生长没影响。同样用DTT处理人 β-防御素-3(hBD-3)和溶菌酶却使抗菌活性降低。为排除DTT的影响,厌氧条件下,培养基不加DTT,发现合成的氧化型hBD-1对双歧杆菌的生长没影响,而线型hBD-1对所检菌株均有抗菌活性。类似结果也在乳酸杆菌中观察到。但没有检测到任何形式的hBD-1对 G -菌Bacteroides vulgatus具抗菌活性。对兼性厌氧菌Escherichia coli K12,氧化型和还原型hBD-1都有抗菌活性。还原型hBD-1对被检测的5株共生致病真菌Candida albicans中的4株有抗菌活性,而氧化型的没有。此外,还原型hBD-1碳端结构有别于氧化型和含游离半胱氨酸的hBD-1,认为这是影响其抗菌活性的重要原因。且还原型hBD-1屏蔽了健康上皮细胞抵抗共生菌和致病性真菌的定植。
Peng等[32]用DTT(5 μmol/L和10 μmol/L)和DMSO(10%和20%)处理重组猪 β-防御素-2(rp-BD2)后与S. aureus ATCC 6538孵育,发现抑菌圈直径大小均与对照相同。表明氧化和还原状态对 rpBD2的抗菌活性没有影响。
2.2 氨基酸突变对防御素抗菌功能的影响 2.2.1 Ala突变对防御素抗菌功能的影响Maemoto等[34]用Ala替代鼠源cryptdin-4(Crp4)中Cys改变其二硫键数量发现,突变体体外抗菌活性(E. coli ML35,Salmonella enterica serovar Typhimurium(serovar Typhimurium)CS022、JSG210和14082,Vibrio cholerae,S. aureus 710a,Listeria monocytogenes 104035)均等于或大于天然Crp4。25 μg/mL 或更低浓度的Crp4与突变体都可使病原菌存活率降低至少1 000倍,但其中3个突变体 C6A/C21A、C4A/C11A/C28A/C29A和C4A/C6A/C11A/C21A/C28A/C29A抗野生型serovar Typhi-murium的活性比母体肽更高。
Lee等[37]报道来自Copris tripartitus(三开蜣螂)含43个氨基酸的coprisin缺少任意一对二硫键都减弱其抗细菌活性,但仍保留抗真菌活性。用丙氨酸替代半胱氨酸形成Cop[Ala3,34],Cop[Ala20,39]和Cop[Ala24,41]突变体,供试菌 G - 性菌有E. coli,Salmonella typhimurium,Pseudomonus aeruginosa;G+菌有S. aureus,S. epidermidis,Bacillus subtilis)和真菌(C. albicans,C. parapsilosis,Malassezia furfur,Trichosporon beigelii),体外实验发现coprisin对细菌MIC为0. 8-3 .1 μmol/L,对真菌MIC为 5-1 0 μmol/L。而Cop[Ala3,34],Cop[Ala20,39]和Cop[Ala24,41]的细菌MIC>100 μmol/L,但抑制真菌作用略有降低。说明3对二硫键对coprisin抗细菌活性必不可少,但对抗真菌活性则没有明显作用。
2.2.2 Ser突变对防御素抗菌功能的影响Wanniarachchi等[35]用丝氨酸或丙氨酸残基替代人 α-防御素-5(HD5)中Cys改变二硫键数量,低浓度HD5ox对E. coli ATCC 25922 和 S. aureus ATCC 25923显示抗菌活性(在2和2.5 μmol/L时菌落值为10 CFU/mL)。去除任何一对二硫键都会降低其抗S.aureus活性。包括HD5[Serhexa]在内的大部分丝氨酸突变体显示不同程度抗E. coli活性,只有HD5[Ser5;20]ox( 3-3 0)(1 0-3 1)表现弱抗菌活性。根据圆二色谱结果推测减少二硫键可增加肽构象灵活性。
Haag等[36]用丝氨酸替代蒺藜状苜蓿Medicago truncatula NCR247中Cys,2 μmol/L的NCR247使Sinorhizobium melilot细胞变大,而NSR247在4 μmol/L时才使S. meliloti细胞开始增大,且程度比NCR247低;同样1 μmol/L的NCR247即可增加S. meliloti DNA含量,而NSR247在4 μmol/L才开始;此外,用10 μmol/L肽处理S. meliloti,NSR247抗菌活性明显比NCR247低。
2.2.3 其他氨基酸突变对防御素抗菌功能的影响Chandrababu等[38]替代hBD-3中的半胱氨酸(依次为A、Y、V、V、K和V),命名为Def-A。两种肽都只在低离子强度(含0.13 mmol/L Ca2+和0.10 mmol/L Mg2+)时才有活性,且Def-A比rHBD-3的MIC值略高(突变体疏水性和正电荷均有所增加)。在高离子强度(0.5 mmol/L Ca2+ 和0.4 mmol/L Mg2+)时,抗菌活性显著降低(MIC ≥ 300 μg/mL)。
2.3 二硫键连接方式对防御素抗菌功能的影响Haag等[36]将M. truncatula中NCR247的二硫键连接方式由 1-2 ,3-4 调整为 1-3 ,2-4 后,用不同浓度的NCR2471-3,2-4处理S. meliloti,发现S. meliloti细胞大小和DNA含量均小于同浓度的NCR2471-2,3-4。但Hoover等[22]将hBD3二硫键连接方式由 1-5 ,2-4 ,3-6 改为 1-6 ,2-5 ,3-4 ,却发现两者对E. coli,S. aureus和C. albicans有相近的抗菌活性(E. coli,S.aureus和C. albicans的LC90分别为5 μg/mL,12 μg/mL和15 μg/mL)。
Sharma等[39]改变二硫键对数及连接方式设计了人 β-防御素-4(HBD4)同系物系列,发现所有同系物(增加了EF)抗菌功能均有增强。其中,含一对二硫键突变体显示出最大抗菌活性。同时,这些同系物二级结构无明显差别。只含一对二硫键同系物H 4-1 d(C3-C6)对细菌(E. coli MG 1655,P. aeruginosa NCTC 6750和S. aureus NCTC 8530)(LC)和真菌(C. albicans)(MFC)致死浓度均 ≤ 5 μmol/L,而含两对二硫键的H 4-2 d(C2-C4和C3-C6)和含3对二硫键的H 4-3 d(C1-C5,C2-C4及C3-C6)显示了略低的抗菌活性,其LC和MFC为 5-1 2.5 μmol/L。H 4-1 d对P. aeruginosa和S. aureus抗菌活性是天然HBD4的四倍,对E. coli抗菌活性是天然HBD4的两倍。H 4-2 d和H 4-3 d对P. aeruginosa及S. aureus的抗菌活性也比HBD4高。这表明改变HBD4二硫键对数和连接方式对抗菌活性的影响尚未发现明显规律。
3 结语防御素制备途径包括天然提取、化学合成和基因工程表达。天然提取方法获得的产物浓度偏低,只能满足实验室研究。化学合成方法成本偏高,且对含有二对以上的二硫键结构合成很难;转基因表达虽成本较低,也易发生错误折叠及二硫键连接难题[1, 40]。显然揭示增减防御素二硫键及其氧化还原状态影响抗菌活性的机制有助于选择科学的生产制备方式。如(1)发现二硫键对防御素抗菌活性影响不大,可选用化学合成方法生产,不强求二硫键配对。(2)对于减少一或两对二硫键后抗菌活性增减剧烈的防御素,需巧用化学合成或基因工程表达,专注二硫键连接成功率和准确率。(3)对高含二硫键且对抗菌功能至关重要的防御素,则需突破二硫键合成和肽折叠技术瓶颈。总之要综合考虑二硫键增减对构象和理化性质稳定性的影响,精准把控二硫键突变体构效关系,夯实产品制备技术基础。
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