2. 上海高科联合生物技术研发有限公司，上海 201206
2. Shanghai Hi-Tech United Bio-Technological R&D Co. Ltd, Shanghai 201206
随着各种抗生素大量使用，细菌耐药性问题日益严重，导致临床治疗困难以及患者病死率增高，严重威胁人类健康[1, 2]。为了控制耐药性细菌引起的感染，迫切需要研发与传统抗生素作用模式不同的新型抗菌药物。噬菌体裂解酶是噬菌体感染宿主晚期表达的一类肽聚糖水解酶。当它体外应用时，能快速水解革兰氏阳性菌的细胞壁，对多重耐药的革兰氏阳性致病菌同样有效，而且不易诱导细菌产生新的抗性[3, 4]。因此，噬菌体裂解酶有望成为新型抗菌药物。裂解酶SAL-1已经进入临床II期，用于治疗对甲氧西林和万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA和VRSA）引起的全身性感染[5]。
目前已被发现的噬菌体裂解酶有1 000多种，一般由N端水解细菌细胞壁的催化结构域（catalytic domain，CAT）和C端特异性靶向细菌细胞壁的结合结构域（cell wall targeting domain，CWT）组成[6, 7]。为进一步提高裂解酶的抗菌活性，国内外研究人员将不同裂解酶之间的功能结构域重新组合，形成新的杂合裂解酶[8]。其中，杂合裂解酶P128已经进入临床II期，用于清除住院患者鼻腔黏膜的金黄色葡萄球菌定植[9, 10]。
选择高抗菌活性的催化结构域，是构建杂合裂解酶的关键[11, 12]。然而，目前还没有研究人员对单独催化域进行系统的活性分析。本研究选择金黄色葡萄球菌噬菌体187裂解酶（Ply187）的CHAP（cysteine and histidine-dependent aminopeptidase/hydrolase）催化结构域，系统分析其抗菌活性、影响因素、抗菌谱，并与临床上已经广泛应用的抗菌蛋白——溶葡萄球菌酶（lysostaphin，Lysn）的催化域（catalytic domain of lysostaphin，CATLysn）进行比较，从而促进针对多重耐药菌的高活性杂合裂解酶设计。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒实验所用的菌株详，见表 1；表达载体pET28a（+）、大肠埃希菌表达菌株BL21（DE3）购自Novagen公司。
限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB公司；DNA Marker、低分子量标准蛋白质购自TaKaRa公司；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自天根生化科技有限公司；IPTG、卡那霉素购自TaKaRa公司；纯化填料购自GE公司；其余常用试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 方法 1.2.1 CHAPPly18的表达和纯化通过GenBank获得噬菌体裂解酶Ply187蛋白序列（Y07740），根据CHAPPly187（1-157 aa）氨基酸序列，选用大肠埃希菌偏爱密码子，人工合成编码CHAPPly187的基因序列，并在5'端引入Nco-位点，3'端引入Hind Ⅲ位点。CHAPPly187基因的人工合成由上海生工生物工程技术有限公司完成，合成基因克隆于pUC57载体的多克隆位点，重组质粒命名为pUC57-CHAPPly187。pUC57-CHAPPly187经 NcoⅠ和Hind Ⅲ双酶切，割胶回收CHAPPly187基因片段，克隆到pET28a（+）载体的NcoⅠ和Hind Ⅲ位点间，构建重组表达质粒pET28a-CHAPPly187，阳性克隆送上海英骏生物公司测序。将测序正确的表达质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，获得表达CHAPPly187工程菌。
挑单克隆接种于LB培养液（含30 mg/L卡那霉素），37℃振荡培养过夜，按1％接种到相同的LB培养液中，37℃振荡培养至光密度值（波长600 nm）≈0.6时，加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG诱导蛋白表达，继续37℃振荡培养，诱导4 h左右，离心收集菌体，菌体重悬于破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-Cl含2 mmol/L EDTA，pH8.0），超声破菌。破菌液4℃，12 000 r/min离心20 min，收集上清液。
将离心后破菌上清液进样至预先用50 mmol/L Tris-Cl pH 9.0缓冲液平衡的Capto MMC阳离子交换层析柱（26 mm × 60 mm），用含1.0 mol/L NaCl 的Tris-Cl缓冲液洗脱，收集目的峰。收集峰经超滤浓缩后，进样至Sephadex G50凝胶过滤层析柱进行精纯，用含150 mmol/L NaCl 的20 mmol/L PBS（pH 7.0）缓冲液进行洗脱，收集目的峰。纯化后的样品经超滤浓缩后置于-20℃冷冻保存备用。
重组溶葡萄球菌酶的催化域（CATLysn）的表达和纯化参考文献[13]。
用12％SDS-PAGE测定重组蛋白样品的大小和纯度。以牛血清白蛋白为标准蛋白，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度。
1.2.2 比浊法测定CHAPPly187抗菌活性采用比浊法测定CHAPPly187的抗菌活性，，在特定条件下细菌悬液浊度下降值代表重组蛋白的酶活。过夜培养的金黄色葡萄球菌（ATCC6538）转接后生长到对数中期（OD600≈0.5），离心（5 000 r/ min）收集菌体。菌体用5 mmol/L PBS（pH 7.3）清洗2次，然后重悬浮于5 mmol/L PBS（pH7.3）缓冲液中。在96孔板中加入15 µL稀释10倍的样品（终浓度为200 nmol/L）和50 µL菌悬液（最终OD600约为0.5），再加入无菌水，使得最终反应体系为200 µL，反应温度设为37℃，在OD600下读数。所有的酶活测定结果为3次重复数据的平均值。
为了检测CHAPPly187的抗菌谱，采用比浊法测定CHAPPly187对葡萄球菌（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌）、藤黄微球菌、肺炎链球菌、停乳链球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的抗菌活性，以CATLysn（终浓度为200 nmol/L）为对照。
1.2.2.1 温度对CHAPPly187抗菌活性的影响在28-41℃范围内，分别测定CHAPPly187的抗菌活性，以CATLysn为对照。
1.2.2.2 pH对CHAPPly187抗菌活性的影响菌体用5 mmol/L PBS（pH 7.3）清洗2次，然后重悬浮于无菌水中。在37℃下，测定pH值的变化（pH 4-5：50 mmol/L NaAC，pH 6-8：20 mmol/L，pH 9-10：100 mmol/L Tris-HCL）对CHAPPly187抗菌活性的影响，以CATLysn为对照。
1.2.2.3 离子强度对CHAPCHAPPly187抗菌活性的影响在37℃和pH 7.3条件下，反应体系中分别加入0、5、10、20、40、60、150和300 mmol/L NaCl时，测定CHAPPly187的抗菌活性，以CATLysn为对照。
1.2.2.4 EDTA和金属离子对CHAPCHAPPly187抗菌活性的影响在37℃和pH 7.3条件下，反应体系中含不同浓度的EDTA或二价金属离子（Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+和Fe2+），分别测定CHAPPly187的抗菌活性，以CATLysn为对照。
1.2.2.5 血清对CHAPPly187抗菌活性的影响在37℃和pH 7.3条件下，反应体系中含0、50%兔血清时，分别测定CHAPPly187的抗菌活性，以CATLysn为对照。
2 结果 2.1 CHAPPly187和CATLysn的表达和纯化将表达的CHAPPly187的重组质粒（图 1-A）转化BL21（DE3）感受态，经IPTG诱导表达，超声破菌，收集破菌上清液。经Capto MMC阳离子交换和Sephadex G50凝胶排阻纯化，SDS-PAGE（图 1-B）显示重组CHAPPly187位于18 kD与理论分子量（17.84 kD）相符，且纯度均大于95%。
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| 图 1 CHAPPly187和CATLysn蛋白序列示意图（A）以及重组催化域的SDS-PAGE分析（B） |
采用比浊法，分别测定CHAPPly187和CATLysn的抗菌活性。结果（图 2）显示，30 min内终浓度为200 nmol/L的单独催化域能将金黄色葡萄球菌的浊度从0.5降至0.1。说明CHAPPly187和CATLysn一样对金黄色葡萄球菌具有非常强的抗菌活性。
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| 图 2 催化域的抗菌活性分析 |
抗菌谱检测结果（图 3）显示，CHAPPly187对葡萄球菌属有非常专一的抗菌作用，且对耐药金黄色葡萄球菌同样有效；CATLysn同样只对葡萄球菌有效，然而其对表皮葡萄球菌和模仿葡萄球菌的抗菌效果明显变弱，分别下降了57%和70%。
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| 图 3 催化域的抗菌谱 1：S. aureus ATCC6538；2：S. aureus ATCC25913；3：S. aureus ATCC27217；4：S. aureus ATCC25923；5：S. aureus ATCC43300；6：S. aureus ATCC33591；7：S. epidermidis ATCC26069；8：S. simulans ATCC27851；9：M. luteus CM-CC28001；10：S. pneumoniae CMCC31201；11：S. dysgalactiae ATCC9926；12：E. faecalis ATCC29212；13：P. aeruginosa ATCC27853；14：E. coli CMCC44102 |
CHAPPly187和CATLysn的最适反应温度为37℃，在28-41℃范围之间，抗菌活性变化不大（数据未显示）。
2.5 pH对CHAPPly187抗菌活性的影响CHAPPly187在pH 6.0-9.0范围内，具有较高的抗菌活性（图 4）；而CATLysn在pH 7.0-9.0，抗菌活性较高。
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| 图 4 pH对催化域抗菌活性的影响 |
在37℃和pH7.3条件下，CHAPPly187随着盐浓度的升高，活性慢慢上升，在20 mmol/L NaCl时的活性最高，随后活性明显下降，盐浓度在300 mmol/L时，基本无活性（图 5）；而CATLysn最适离子强度为0-5 mmol/L NaCl，随着盐浓度的升高，活性急剧下降，在60 mmol/L NaCl时活性只有原来的1%。
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| 图 5 离子强度对催化域抗菌活性的影响 |
CHAPPly187随着反应体系中EDTA浓度的升高，活性快速下降，在1 mmol/L EDTA时，基本无活性（图 6）；CATLysn随着EDTA浓度的升高，活性缓慢下降，当EDTA的浓度超过20 mmol/L时，抗菌活性只有原来的5%。
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| 图 6 EDTA对催化域抗菌活性的影响 |
CHAPPly187随着反应体系中Ca2+、Mg2+浓度的上升，活性有显著的提高，在1 mmol/L时的活性最高，提高60%左右，随后活性开始下降，浓度在8 mmol/L时，开始有轻微抑制（图 7-A）；Mn2+、Ba2+在0.5 mmol/L时对CHAPPly187的活性有明显的促进作用，浓度在4 mmol/L以上开始有抑制作用。Fe2+、Zn2+、Cu2+金属离子在极低浓度（3 µmol/L）时，有促进作用，随后开始产生抑制作用，浓度达100 µmol/L时，CHAPPly187基本无活性（图 7-B）。
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| 图 7 二价金属离子对催化域抗菌活性的影响 |
CATLysn随着反应体系中Ca2+、Mg2+、Mn2+浓度的上升，活性有显著的提高，在50 µmol/L左右活性最高，提高40%左右，随后活性开始下降，在检测浓度范围内，Ca2+没有产生抑制作用，Mg2+、Mn2+浓度达到1 mmol/L时，有轻微抑制作用（图 7-C）。Ba2+在0-1 mmol/L时，对CATLysn的抑制作用不断增加。Fe2+在极低浓度（3 µmol/L）时，有明显促进作用，随后产生抑制作用（图 7-D），Zn2+、Cu2+对CATLysn的抑制作用非常明显，尤其是Cu2+，在10 µmol/L时几乎完全抑制CATLysn的活性。
2.8 血清对CHAPPly187抗菌活性的影响当反应体系中含有50%的兔血清时，测不出CHAPPly187和CATLysn对金黄色葡萄球菌的裂解活性。
3 讨论随着抗生素的广泛使用，多重耐药菌在临床上的检出率越来越高，治疗耐药菌感染变得非常困难，因此迫切需要研发新型抗菌药物[1, 14]。大量的研究表明，噬菌体裂解酶可以成为克服耐药菌感染的抗菌药物[15, 16]。目前，一些高效、安全的噬菌体裂解酶已经进入临床研究阶段[5, 9, 10]。针对特定耐药菌，研究人员通过设计杂合噬菌体裂解酶来提高抗菌活性[17-20]。从1 000多个催化域中筛选出具有高抗菌活性的目标，是设计高效的杂合裂解酶的关键[21]。
CHAPPly187属于依赖组氨酸、半胱氨酸肽酶家族的一类催化域[22, 23]，其主要作用位点位于细胞壁肽聚糖侧链的丙氨酸与肽键桥中第一位甘氨酸之间形成的肽键，其活性中心含Ca2+[24, 25]。CATLysn属于金属蛋白酶，其作用位点位于细胞壁肽聚糖中五甘氨酸肽键桥的第2与第3位甘氨酸之间形成的肽键，其活性中心含Zn2+[26]。两者的作用底物的位置非常相近。
CHAPPly187和CATLysn对金黄色葡萄球菌的抗菌活性比较相似，说明CHAPPly187是一个活性非常强的噬菌体裂解酶催化域，这与Mao等[27]报道单独Ply187的CHAP活性很低的结果不同，主要是因为他们在使用比浊法检测活性时，在缓冲液体系中加入一定浓度的NaCl，从而影响了催化域与细菌细胞壁之间的静电吸附[13]。抗菌谱研究表明，CHAPPly187对葡萄球菌属非常专一，相比CATLysn，CHAPPly187对表皮葡萄球菌和模仿葡萄球菌具有更好的效果，因为表皮葡萄球菌和模仿葡萄球细胞壁肽键糖中五甘氨酸肽键桥的部分甘氨酸被丝氨酸取代，从而对CATLysn产生一定的耐受[28]。
环境pH对催化域的活性有显著影响，对pH的耐受性决定了裂解酶的临床应用范围，CHAPPly187的最适作用pH为6.0-9.0，比CATLysn（pH 7.0-9.0）宽泛些，结果与文献报道一致[29]。CATLysn的活性随着环境离子强度的升高而急剧下降（图 5），而CHAPPly187催化域在20 mmol/L NaCl时活性最高，且随着NaCl浓度的上升，活性缓慢下降，表明CHAPPly187对离子强度的耐受性优于CATLysn。
CHAPPly187和CATLysn的活性中心都带有二价金属离子，当检测环境中含1 mmol/L的EDTA时，EDTA几乎完全抑制200 nmol/L CHAPPly187的活性；而完全抑制CATLysn的活性，至少需要20 mmol/L以上的EDTA，说明CATLysn对活性中心的金属离子结合更加紧密。进一步研究二价金属离子对催化域活性的影响，发现大部分二价金属离子在低浓度时表现出促进作用，随着浓度的升高开始产生抑制作用，而Zn2+和Cu2+主要表现为强的抑制作用。Filatova 等[30]研究表明CHAP家族的活性位点需要Ca2+、Mg2+激活。
本研究系统比较了CHAPPly187和CATLysn的生物活性，它们对临床主要病原菌金黄色葡萄球菌的抗菌活性都非常强，但在不同条件下，活性表现不尽相同。由于本研究选择的催化域有限，相信有更好的催化域可被用来设计杂合裂解酶，用于治疗耐药性细菌感染。在下一步的工作中，将选择更多的催化域进行表达和活性研究。
4 结论本研究是首次将单独催化域CHAPPly187与溶葡萄球菌酶的催化域CATLysn进行抗菌活性比较，成功地获得高纯度CHAPPly187重组蛋白，并且系统的分析了不同温度、不同pH、不同离子强度、EDTA和金属离子等影响因素对其抗菌活性的影响。
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