目前研究认为，癌症发生的主要原因是细胞增殖和细胞死亡失调，后者包括程序性死亡（如细胞凋亡）和非程序性死亡。当前存在许多治疗各种癌症的化学药物[1]，但因其毒副作用大，以及肿瘤细胞易对其产生耐药性而在临床上受到限制[2]。抗菌肽（AMPs）是一组在先天免疫防御中发挥重要作用的天然分子[3]。与目前广泛使用的化疗药物相比，抗菌肽具有抗肿瘤细胞活性而对正常细胞几乎无毒害作用，而且尚未发现肿瘤细胞对其产生耐药性[4]。例如LL-37，唯一一个来自人的免疫防御肽，可以诱导结肠癌细胞凋亡[5]。因此，抗菌肽有望成为一种新型的抗肿瘤药物。
在许多亚洲国家，少棘蜈蚣毒液及机体被广泛用来治疗神经、呼吸道和心血管疾病。然而，来自蜈蚣且已报道的蛋白或多肽类却寥寥无几[6]。其中scolopendin 1 和 scolopendin 2是分别来自于少棘蜈蚣毒液的同源抗菌肽，分子量分别为5.270 kD和1.781 kD[7, 8]。本研究所涉及到的另一种来自于少棘蜈蚣毒液的新型AMP-scolopin 2也已被分离出来，氨基酸序列为GILKKFMLHRGTKVYKMRTLSKRSH，分子量为3.018 kD，具有广谱抗菌活性，对多种革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌都有抗菌活性[9]。
由于大肠杆菌具有表达水平高、培养简单和成本低廉等特点，常被作为首选的重组蛋白表达的宿主。然而，重组蛋白在大肠杆菌中的表达常以包涵体的形式存在，可溶性很低。SUMO是一种可以共价连接到其它特定靶蛋白上的修饰蛋白，具有亲水表面和疏水核心，这样它可以通过类似于去污剂效应来增强靶蛋白的可溶性[10]。此外，SUMO蛋白裂解酶能识别SUMO标签蛋白序列，并能高效且完整地把SUMO从融合蛋白上切割下来[11]。家蚕AMP-CM4已通过SUMO融合表达纯化系统成功地进行了表达[12, 13]。本实验尝试利用该表达体系对少棘蜈蚣AMP-scolopin 2进行表达并研究其活性，旨在探究一种新型抗菌肽AMP-scolopin 2的抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的活性功能及其作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物、菌株与细胞株实验小鼠购自南京大学模式动物研究中心；大肠杆菌E. coli BL21（DE3）、K12D31、DH5α、pSUMO、肝癌细胞株Hep-G2和白血病细胞株K562均由本实验室保存。
1.1.2 试剂和耗材凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自Axygen公司；限制性内切酶Hind Ⅲ和Stu I、T4 DNA ligase、Taq DNA聚合酶、DNA Marker和蛋白质Marker购自TaKaRa Biotech 公司；碱性磷酸酶和磷酸激酶购自Fermentas公司；Tyrptone和Yeast Extract购自OXOID公司；鼠His6一抗和羊抗鼠IgG购自TIANGEN公司；FITC标记的羊抗鼠IgG抗体购自R&D Systems公司；IPTG购自Promega公司；SDS、Kan、Acr和Bis购自Amresco公司；TEMED购自Bio-Rad公司；0.22 μm的无菌滤器购自Millipore公司；DMEM培养基、RPMI1640和FBS购自GIBCO公司；细胞培养板购自Costar公司；所需引物由上海Invitrogen公司合成。
1.1.3 实验仪器PTC-200 PCR仪（美国MJ Resea-rch公司）、CO2培养箱（日本NAPCO公司）、低温离心机（美国Sigma公司）、摇床（江苏太仓）、Mu-ltiTempⅢ恒温水浴锅、高速离心机（Eppendorf公司）、水平板电泳（美国Bio-Rad）、电热干燥箱（熊猫公司）、凝胶图像采集与分析软件（Ultra-Violet公司）、超纯水仪（Sartorius 公司）、流式细胞仪（美国BD公司）、ELx800型酶联免疫检测仪（美国BLO-TEK公司）、JY92-2D超声波细胞粉碎机（中国新芝科器研究所）、倒置显微镜（美国COIC公司）、Allegar 21R台式高速冷冻离心机（美国BECKMAN公司）、超净工作台（中国苏净集团）。
1.2 方法 1.2.1 PCR扩增scolopin2基因 利用大肠杆菌密码子偏爱性软件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/）设计AMP-scolopin 2的引物：P1：5′-GGTATCCTGAAGAAATTCATGCTGCATCGTGGTACCAAAGTTTAC-3′；P2：5′-ATGAGAACGTTTAGACAGGGTACGCATTTTGTAAACTTTGGTACC-3′。用上述引物进行PCR反应。扩增参数：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，50 ℃ 延伸30 s，72 ℃ 退火20 s，30个循环；72 ℃ 延伸7 min。进行2.5﹪琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物，利用Axygen胶回收试剂盒割胶纯化scolopin 2基因。
1.2.2 融合表达载体的构建根据以上PCR纯化得到的scolopin 2模板，设计一对分别含有Stu I和Hind Ⅲ酶切位点的基因特异性引物：P3：5′-TGGAGGCCTAAGAAATTCA-3′（Stu I）；P4：5′-CCCAAGCTTTCAATGAGAAC-3′（Hind Ⅲ）。用上述引物进行PCR反应。扩增参数：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，50 ℃ 延伸30 s，72 ℃ 退火20 s，30个循环；72 ℃ 延伸7 min。进行2.5﹪琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物，利用Axygen胶回收试剂盒割胶纯化SUMO-scolopin 2基因。
接种含空质粒pSUMO的E. coli DH5α空质粒单克隆于3 mL 含E. coli DH5α的LB培养液培养基中（含Kan+终浓度为50 μg/mL），37 ℃ 振荡培养过夜；用AxyGEN质粒提取试剂盒提取并纯化pSUMO质粒；Stu I和Hind Ⅲ双酶切以上PCR产物和pSUMO质粒，通过连接反应，将获得的连接产物转入感受态细胞E. coli DH5α；最后挑选阳性克隆（8个）送上海英潍捷基公司测序并鉴定。
1.2.3 SUMO-scolopin2蛋白表达纯化 将测序正确的融合表达载体转入表达菌E. coli BL21（DE3）中，利用IPTG（0.5 mmol/L）诱导SUMO-scolopin 2表达，经Ni柱亲和层析纯化后得SUMO-scolopin 2蛋白，最后进行Western blot鉴定。
1.2.4 AMP-scolopin2的切割与纯化 将上述纯化后的SUMO-scolopin 2蛋白与SUMO蛋白酶以1 ∶ 100（V/V）比例混合，30 ℃ 水浴1 h；将酶切混合物进行Ni柱亲和层析，收集流出液；进行SDS-PAGE检测。
1.2.5 重组蛋白AMP-scolopin 2的生物活性检测 1.2.5.1 抗菌活性检测采用琼脂糖孔穴扩散法测定AMP-scolopin 2对E. coli K12D31的抗菌活性。将培养至对数生长期的E. coli K12D31按终浓度为1%的量加至融化的液体LB培养基中，混匀后倒平板，待凝固后，在无菌条件下打孔，加入待测样品于37 ℃ 培养8 h，观察抑菌活性。
1.2.5.2 MTT细胞增殖抑制作用将1×105个/mL的K562、HepG2和HEK293细胞分别接种于96孔板，0.2 mL/孔；待培养4 h后，分别加不同浓度的AMP-scolopin 2于37 ℃ 培养24 h，吸去废液，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）和80 μL培养基，培养4 h后小心弃掉上清，每孔加150 mL DMSO，避光振荡15 min；在酶标仪490 nm处测定吸光值。
1.2.5.3 细胞凋亡检测分别将1×106个/mL的K562和HepG2细胞接种于6孔板，培养4 h后，加入不同浓度的AMP-scolopin 2处理12 h，收集各组细胞；分别按Annexin V-FITC/PI apoptosis kit试剂盒说明书操作，用FACS Calibur流式细胞仪检测。
1.2.5.4 Western blot检测接1×106个/mL的K562和HepG2细胞于6孔板，培养4 h，加不同浓度AMP-scolopin 2处理12 h后收集于1.5 mL离心管中；分别加100 μL loadingbuffer裂解细胞，并超声破碎后进行SDS-PAGE电泳；转膜于硝酸纤维素膜（NC）上，TBST（8.8 g NaCl，20 mL 1 mol/L的Tris-HCl，0.5 mL Tween20，pH8.0）振荡洗3次，每次5 min；用5%（W/V）的脱脂奶粉缓慢振荡封闭1 h；一抗4 ℃ 孵育过夜；TBST振荡洗3次，每次5 min；二抗室温孵育1 h；同样经PBST清洗后，使用奥德赛扫描NC膜并分析结果。
1.2.5.5 溶血性实验小鼠眼球取血1.5 mL，3 000×g 水平离心15 min后弃掉上清；加入5 mL 0.9%的生理盐水洗至上清澄清；按8%（V/V）稀释后，每孔加200 μL于96孔板中；生理盐水（NS）为阴性对照，Triton X-100为阳性对照，其余加不同浓度的AMP-scolopin 2，均37 ℃ 孵育1 h后，在酶标仪414 nm处检测吸光值；溶血性的计算公式为：（Apeptide-ANS）/（ATritonX-100-ANS）。
2 结果 2.1 SUMO-scolopin 2克隆及其融合蛋白表达体系的构建克隆所得AMP-scolopin 2的基因序列为75 bp，构建融合表达载体pSUMO-scolopin 2为5 550 bp左右（图 1-A），通过测序验证，融合表达载体序列完全正确。转入pSUMO-scolopin 2质粒的E. coli BL21（DE3）在IPTC诱导之后，37 ℃ 振荡培养。离心后取其上清液及经过镍柱层析的洗脱液进行SDS-PAGE电泳，结果（图 1-B）显示，经IPTG诱导之后在约23 kD处出现了一条带，免疫印迹证明，这条带是融合蛋白SUMO-scolopin 2。
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| 图 1 SUMO-scolopin 2表达体系的构建 A：pSUMO-scolopin 2 融合表达载体的构建；B：镍柱亲和层析获得融合蛋白。M：DNA Marker；1：经IPTC诱导的转入pSUMO-scolopin 2的E. coli BL21（DE3）上清液；2，3：亲和层析洗脱液；4：亲和层析洗脱液浓缩后；5：Western blotting |
融合蛋白表达纯化后，使用SUMO特异性的切割酶进行了切割，结果（图 2）显示，Tricine/SDS-PAGE得到了约3 kD的scolopin 2蛋白和约20 kD的SUMO标签，又经过一次Ni柱亲和层析，得到了单一条带的AMP-scolopin 2蛋白。
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| 图 2 Tricine/SDS-PAGE进行重组目的蛋白切割（A）与纯化（B） M：蛋白Marker；1：融合蛋白；2：融合蛋白经酶切后为SUMO标签蛋白和scolopin 2蛋白；3：亲和层析获得目的蛋白AMP-scolopin 2 |
为了检测AMP-scolopin 2的抗菌活性，使用了敏感菌株E. coli K12D31作为试验菌的琼脂糖孔穴扩散法。结果（图 3）显示，SUMO-scolopin 2在融合状态下并没有抗菌活性，AMP-scol-opin 2具有与化学合成的抗菌肽相似的抗菌活性。
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| 图 3 孔穴法检测重组抗菌肽的抗菌活性 1：PBS；2：SUMO-scolopin 2（20 μmol/L）；3：化学合成AMP-scolopin 2（20 μmol/L）；4：重组AMP-scolopin 2（15 μmol/L） |
通过对癌细胞毒性的筛选，发现AMP-scolopin 2对白血病细胞K562和肝癌细胞HepG2具有抑制增殖的作用。实验中，两种细胞都表现出对AMP-scolopin 2具有浓度依赖性增殖抑制作用，如图 4所示，用10 μmol/L scolopin 2处理K562细胞就会导致80%存活，而用60 μmol/L scolopin 2处理细胞，则会导致存活率降低到20%，半数致死率的浓度IC50为25 μmol/L；在HepG2细胞中，半数致死率的浓度为50 μmol/L。
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| 图 4 MTT检测AMP-scolopin 2对肿瘤细胞增殖的抑制作用 A：不同浓度AMP-scolopin 2对K562细胞毒性；B：不同浓度AMP-scolopin 2对 HepG2细胞毒性；**：差异极显著（P＜0.01，n=3，x±s），下同 |
使用流式细胞仪通过Annexin V 和碘化丙啶（PI）双染发现，AMP-scolopin 2可以通过凋亡作用抑制细胞增殖。如图 5所示，40 μmol/L AMP-scolopin 2可以明显地引起21.4% K562细胞凋亡；AMP-scolopin 2在HepG2细胞中，存在相似作用。
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| 图 5 流式细胞术检测AMP-scolopin 2对肿瘤细胞的促凋亡作用 A - C：K562细胞，PBS：阴性对照；AMP-scolopin 2浓度：20和40 μmol/L。D - F：HepG2细胞；PBS：阴性对照；AMP-scolopin 2浓度：20和50 μmol/L |
为了进一步确认细胞的凋亡通路，检测了细胞凋亡相关蛋白pro-caspase-3、pro-caspase-9和pro-PARP。Western blotting实验结果（图 6）显示，在K562和HepG2细胞中，pro-caspase-3 随着AMP-scolopin 2的浓度依赖性地减少，表明pro-caspase-3被切割，暗示了caspase-3已被激活，且检测到其上游蛋白pro-caspase-9也下调，更证明了这一点。另外，还检测到caspase-3的下游蛋白pro-PARP也表现出同样下降的趋势。
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| 图 6 Western blotting检测细胞凋亡的分子机制相关蛋白 A：HepG2细胞；CK：阴性对照组；AMP-scolopin 2浓度：10、20和50 μmol/L；B：K562细胞；CK：阴性对照组；AMP-scolopin 2浓度：10、20和40 μmol/L |
为了检测重组蛋白的毒副作用，对小鼠红细胞进行了溶血性实验，使用人胚肾细胞HEK293进行了增殖抑制实验。图 7-A显示，在实验用量范围内，无溶血活性，即使AMP-scolopin 2浓度加大至远高于IC50的120 μmol/L时，也仅出现30%的溶血；图 7-B显示，当AMP-scolopin 2的浓度达到120 μmol/L时，细胞存活率仍为80%，与对照组无明显差别，故在实验用量范围内，AMP-scolopin 2对正常细胞（HEK293）的毒副作用很小。
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| 图 7 AMP-scolopin 2对红细胞和正常细胞的毒性研究 A：不同浓度梯度的AMP-scolopin 2对红细胞的溶血性检测；B：不同浓度梯度AMP-scolopin 2对正常细胞（HEK293）的存活率检测 |
少棘蜈蚣栖身土壤，生存环境中不可避免存在着致病菌，在捕食和遭遇外来侵害时，激发其产生一系列的抗菌物质。蜈蚣的毒腺位于头部颚肢，捕食时，将毒颚刺入猎物体内并注入毒液，使之麻痹甚至死亡。Rates等[14]研究表明，少棘蜈蚣的毒液具有很重要的生物学研究价值。Peng等[9]从少棘蜈蚣毒液中分离得到两种抗菌肽，命名为scolopin 1 和scolopin 2，其氨基酸序列分别为FLPKMSTKLRVP-YRRGTKDYH 和 GILKKFMLHRGTKVYKMRTLSKR-SH。AMP-scolopin 2具有广谱抗菌活性，对人和兔红细胞有溶血性，但对抗肿瘤活性的研究尚无报道[9]。
本实验室对原核表达系统做了较多研究，如Trx和Nus等蛋白标签，它们采用化学方法或蛋白酶切的方式从融合蛋白上去除。这些方式最大的弊端就是在蛋白的N端留下一个多余的氨基酸，而蛋白质的N端对于蛋白质的稳定性、功能的发挥或者修饰都起着重要的作用。在本实验中，使用SUMO 特异性蛋白酶切割的方法去掉SUMO标签，切割之后，在N端没有留下多余的氨基酸。SUMO酶是一种可以识别标签蛋白的三级结构的酶，能够在SUMO蛋白的C端两个甘氨酸处切割[11, 15]。本研究首次构建了pSUMO-scolopin 2原核表达载体，通过优化表达体系，最后得到目的蛋白AMP-scolopin 2；进行抗菌活性实验，表明与化学合成的抗菌肽具有相似活性，对后面进一步改造、修饰该抗菌肽做好充足的准备。
在哺乳动物细胞中，细胞凋亡通常通过两条caspase-dependent（胱天蛋白酶依赖）分子途径，即内源性和外源性途径[16]。本实验首先证明AMP-scolopin 2 对白血病细胞K562、肝癌细胞HepG2具有抑制增殖作用，然后通过流式细胞仪检测AMP-scolopin 2处理上述细胞，发现AMP-scolopin 2可以通过诱导凋亡的方式来杀伤肿瘤细胞。细胞中caspase-3是细胞凋亡中起最终执行作用的重要剪切酶，以低活性酶原pro-caspase-3的形式合成，只有当pro-caspase-3被活化后才能发挥作用；而非活化态pro-caspase-3可被上游活化态分子caspase-9切割成活化状态（即：两个cleaved caspase-3），进而激活下游信号蛋白PARP，最终导致细胞凋亡[16, 17]。通过对引起细胞凋亡的线粒体通路的下游分子检测发现，pro-caspase-3、pro-caspase-9和pro-PARP的被切割程度随着AMP-scolopin 2浓度的递增而增强，说明AMP-scolopin 2可以通过线粒体通路引起细胞的凋亡，从而在体外达到抑制肿瘤细胞增殖的效果。另外，体外细胞毒性实验表明 AMP-scolopin 2在实验剂量范围内对鼠红细胞没有溶血性，且对正常细胞（HEK293）的毒性也很小。AMP-scolopin 2拥有的抗肿瘤活性作用、溶血性小、对正常细胞毒副作用低等特点，使其有望成为新型的抗肿瘤药物，值得进一步深入研究。
4 结论成功构建了pSUMO-scolopin 2原核表达载体，并获得具有抗菌抗肿瘤活性的重组AMP-scolopin 2，而且证明AMP-scolopin 2 可通过调节线粒体通路相关蛋白的表达来促进肿瘤细胞（K562和HepG2）的凋亡。
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