2. 河北大学药学院，保定 071002
2. College of Pharmaceutical Sciences of Hebei University，Baoding 071002
Fc受体（FcR）广泛表达于免疫活性细胞，介导免疫细胞与抗原 - 抗体复合物及其他细胞间的相互作用，触发广泛的免疫效应[1]。FcγRIIb（Fc gamma receptor IIb，FcγRIIb，即 CD32B）是目前发现的唯一 Fcγ抑制性受体，在免疫、肿瘤、感染性疾病、自体免疫性疾病等方面发挥的负性调节作用，受到越来越多学者的关注[2]。FcγRIIb广泛分布于B细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和嗜中性粒细胞，及除CD8记忆性T细胞外的其他T细胞和NK细胞以外的所有白细胞[3, 4]。FcγRIIb 可主要依赖其胞内区的 ITIM 抑制基序介导对多种免疫细胞的负向调节效应，如抑制依赖于钙动员的脱颗粒作用、吞噬作用、抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）以及各种介质的释放等[5, 6]。FcγRIIb功能失衡常与多种疾病密切相关，这使人们认识到FcγRIIb可以作为一个潜在的治疗靶标。目前，人们设计了FcγRIIb单克隆抗体阻断FcγRIIb，从而增强对癌症或感染性病原的免疫反应，或者设计融合蛋白或双特异性抗体将FcγRIIb与激活型受体交联发挥其在自身免疫性疾病中的抑制作用等[7, 8]。
由于FcγRIIb的膜外区部分为与IgG直接作用位点，为了便于评价及进行动物实验，本实验首次克隆大鼠FcγRIIb基因膜外区，即FcγRIIb，并在原核表达系统中进行表达，制备高纯度的具备生物学活性的重组蛋白，旨为进一步探索FcγRIIb功能奠定实验基础。
1 材料与方法 1.1 材料DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、pUCm-T载体、大鼠IgG、HRP标记的羊抗大鼠单克隆抗体、多克隆兔抗大鼠sFcγIIb抗体、HRP标记的羊抗兔单克隆抗体，Ni-NTA购自上海生工生物有限公司；DNA marker DM2000、DM10000，Taq酶、dNTPs、超纯RNA提取试剂盒、SuperRT第一链合成试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶Pst I、Nde I、EcoR I、蛋白Marker等购自大连宝生物工程有限公司；X-gal、TEMED购自SIGAMA；Tryptone、Yeast Extract购自OXOID；其他常用试剂为国产分析纯试剂。
大鼠嗜碱性白血病细胞系RBL-2H3细胞购自上海中国科学院细胞库。菌株：DH5α和大肠杆菌BL21（DE3）均由本实验室保存；原核表达载体：pET-17b由本实验室保存。
1.2 方法 1.2.1 引物的设计参照GenBank 中FcγIIb基因序列（登录号：BC091113.1），采用Primer 5.0软件设计特异性引物，下划线序列分别为EcoR I酶、Pst I、Nde I酶切位点，斜体序列为6×His。FcγIIb及sFcγIIB基因的PCR扩增引物及产物测序均由上海生工生物有限公司合成。
RT-PCR方法克隆FcγIIb基因，取生长良好的RBL-2H3细胞，提取总RNA，总RNA提取和反转录参照超纯RNA提取试剂盒和SuperRT第一链合成试剂盒说明书进行。以p1和p2作为上下游引物，扩增FcγIIb全基因，纯化后的PCR产物与pUCm-T载体连接。以p3和p4作为上下游引物，亚克隆sFcγIIb基因片段。sFcγIIb基因片段与pET-17b质粒，分别经Nde I和EcoR I双酶切，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经PCR、双酶切鉴定后进行测序验证。
1.2.3 sFcγIIb蛋白的表达、纯化及复性取测序准确的pET-17b-sFcγIIb/BL21（DE3）克隆接种于含Amp的LB液体培养基中，3 7 ℃ 振荡过夜。取上述菌液按照1 : 100的比例接种于1 L含Amp的LB液体培养基中，37 ℃ 振荡培养至OD600约为0.6，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，诱导蛋白表达，继续培养4 h，收集菌体。超声波破碎菌体，分别收集沉淀和上清，采用12% SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，同时以pET-17b空质粒作对照。对IPTG浓度及诱导时间进行优化，摸索sFcγRIIb蛋白表达体系。
收集蛋白表达包涵体于8 mol/L尿素缓冲液中，4 ℃ 过夜搅拌溶解，上清过0.45 μm滤膜。向Ni-NTA柱中加入2倍体积的Ni-NTA柱平衡缓冲液，加入溶解有包涵体的8 mol/L尿素缓冲液，20 mmol/L咪唑柱平衡缓冲液洗脱杂蛋白，250 mmol/L咪唑柱平衡缓冲液洗脱目的蛋白。将纯化后的包涵体转移至透析袋中，进行透析复性，12% SDS-PAGE电泳检测结果。
1.2.4 Western blotting鉴定取复性前与复性后的sFcγIIb蛋白，与同体积2×SD S-蛋 白上样缓冲液混匀后进行SDS-PAGE电泳，煮沸5 min，待冷却后每种sFcγIIb蛋白分别采取5 μL、10 μL两个不同的量，进行SDS-PAGE电泳。以pET-17b/BL21（DE3）诱导后菌体的裂解产物作为阴性对照。加入一抗（1 : 200稀释的抗FcγRIIb兔多克隆抗体）和二抗（1 : 1 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG抗体）对表达蛋白进行鉴定
1.2.5 ELISA鉴定sFcγRIIb蛋白活性 1.2.5.1 直接法检测IgG与sFcγRIIb蛋白的体外结合将sFcγRIIb蛋白以碳酸盐缓冲液稀释至10 μg/mL，包被酶标板，4 ℃ 过夜。以10 μg/mL的BSA作为阴性对照。PBST清洗5次，加入含5%脱脂奶粉的PBS，37 ℃ 孵育2 h。PBST清洗5次，加入不同浓度的大鼠IgG（ 0-5 0 μg/mL），各设立3个平行孔，37 ℃ 孵育2 h。PBS T清洗5次，加入HRP标记的羊抗大鼠多克隆抗体（1 : 8 000），37 ℃ 孵育2 h。PBST清洗5次，加入100 μL TMB底物缓冲液，室温反应20 min。加入50 μL终止液，测定OD450值。
1.2.5.2 竞争法检测大鼠IgG与sFcγRIIb蛋白的体外结合方法见1.2.5.1，在第3个步骤中，加入50 μg/mL 大鼠IgG与不同浓度的（ 0-5 0 μg/mL）sFcγRIIb的混合物，其余步骤相同。
1.2.5.3 间接法检测大鼠IgG与sFcγRIIb蛋白的体外结合将大鼠IgG以碳酸盐缓冲液稀释至10 μg/mL，包被酶标板，4 ℃ 过夜。以10 μg/mL的BSA作为阴性对照。加入含5%脱脂奶粉的PBS，37 ℃ 孵育2 h。分别加入不同浓度的sFcγRIIb（ 0-5 0 μg/mL），设立3个平行孔，37 ℃ 孵育2 h。加入多克隆兔抗大鼠sFcγIIB抗体（1 : 4 000），37 ℃ 孵育2 h。加入HRP标记的羊抗兔单克隆抗体（1 : 8 000），37 ℃ 孵育2 h。加入100 μL TMB底物缓冲液，室温反应20 min。加入50 μL终止液，测定A450值。期间每加入不同溶液后，均用PBST清洗5次。
2 结果 2.1 重组质粒的构建RNA提取结果显示，可见28S、18S和5S 3个RNA条带，且28S rRNA条带亮度约为18S rRNA条带亮度的2倍，OD260/OD280的值为2.08，满足实验要求（图 1-A）。RT-PCR扩增FcγIIb全长基因（图 1-B）及sFcγRIIb基因（图 1-C）后经1%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物长度为1 049 bp和528 bp，与预期大小一致。
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| 图 1 RT-PCR法克隆FcγIIb基因 |
重组质粒pET-17b-sFcγIIb，经EcoR I和Nde I双酶切后产生了约为528 bp的酶切片段，与PCR扩增所得的FcγIIb基因片段大小相符（图 2）。构建的载体经测序分析，确认插入片段及引物、限制性酶切位点准确无误，与GenBank中大鼠FcγRIIb基因胞外区序列相一致。
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| 图 2 重组质粒FcγRIIb-pET17b的双酶切鉴定 M：DNA 标记DM2000; 1：sFcγRIIb 基因；2： Pst I/Nde I双酶切FcγRIIb-pET17b产物 |
IPTG是诱导重组蛋白表达的关键因素之一，通过对不同IPTG浓度进行优化，结果（图3）显示，随着IPTG浓度增加至1.0 mmol/L时，sFcγRIIb蛋白表达量最高，可达总蛋白的14.45%，IPTG浓度大于1.0 mmol/L时，蛋白表达呈下降趋势，这可能与IPTG对BL21（DE3）菌的毒害作用有关。不同诱导时间对sFcγRIIb蛋白表达影响显著，如图 4所示，蛋白表达量与诱导时间呈正相关，4 h时蛋白的表达量最高（14.39%），与5 h、6 h蛋白表达结果无显著性差异。
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| 图 4 不同IPTG浓度及诱导时间对sFcγRIIb蛋白表达的影响 |
本实验表达sFcγRIIb蛋白以包涵体形式存在，包涵体洗涤进行初步纯化后，将包涵体溶于高浓度变性剂中，镍柱进一步纯化后的蛋白，经多次透析复性，获得了纯度较高的目的蛋白，可以用于后续的实验（图 5）。各纯化和复性步骤中蛋白回收得率与纯度，见表 2。
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| 图 5 sFcγRIIb蛋白表达与纯化 M：蛋白分子量标记；1： pET17b/BL21(DE3) 诱导 4 h；2-4：pET17b-sFcγRIIbRIIb/BL21（DE3）诱导4 h后沉淀与上清；5：Trixon-100 洗后的包涵体；6：2 mol/L urea洗后的包涵体；7：8 mol/L urea 洗后的包涵体；8：Ni-NTA 纯化后蛋白；9：复性后蛋白 |
取复性前、后sFcγRIIb蛋白，进行Western blotting检测（图 6），同时以pET-17b/BL21（DE3）诱导后裂解产物作为阴性对照，结果显示复性前、后sFcγRIIb蛋白均与特异性抗体反应，出现明显阳性条带。
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| 图 6 重组蛋白的Western blotting分析 1：5 μL变性sFcγRIIb蛋白；2：10 μL变性sFcγRIIb蛋白；3：5 μL复性sFcγRIIb蛋白；4：10 μL复性sFcγRIIb蛋白；5：阴性对照 |
包被sFcγRIIb蛋白后，大鼠IgG与sFcγRIIb蛋白之间的结合情况如图 7所示，在一定范围内随着IgG浓度的增加，两者结合量也相应增加。
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| 图 7 直接法ELISA检测IgG与sFcγRIIb蛋白的体外结合 |
包被sFcγRIIb蛋白后，将不同浓度的sFcγRIIb与大鼠IgG混合后再加入到酶标板中，分析两者的结合。结果（图 8）表明，游离的sFcγRIIb抑制了大鼠IgG与包被于酶标板上的sFcγRIIb蛋白的结合，随着游离sFcγRIIb的浓度增加，结合的大鼠IgG浓度呈下降趋势。
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| 图 8 竞争法ELISA检测sFcγRIIb与IgG的结合 |
包被大鼠IgG后，通过加入不同量的sFcγRIIb蛋白，观测二者结合情况。结果（图 9）显示，在一定浓度范围内，随着sFcγRIIb浓度增加，两者间结合量也相应增加。
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| 图 9 间接法ELISA检测sFcγRIIb与IgG的结合 |
FcγRIIb作为唯一的抑制型FcRs，通过与其他激活型受体如FcγRI、FcγRIII、FcγRIV、FcεRI及B细胞受体（BCR）等交联而发挥抑制作用。在肥大细胞和嗜碱性粒细胞中，FcγRIIb1或FcγRIIb2与激活型受体的成簇可以抑制脱颗粒反应。B细胞表面的FcγRIIb1参与对抗体产生和B细胞增殖的负性调节作用，通过特异性IgG的Fab段与B细胞受体结合而Fc段与FcγRIIb1结合，从而转导抑制性信号[9, 10]。
FcγRIIb抑制性功能的发挥依赖于其胞内区的ITIM基序。在FcγRIIb中，ITIM基序包含13个氨基酸残基，含有数种抑制性受体的共有序列V/IxYxxL[11]。FcγR基因位于染色体1的长臂（1q2 1-2 3），位于这一基因簇的数个FcγR的基因非常相似，不同物种间具有明显差异[12]。人与鼠FcγR包括FcγRI、FcγII、RFcγRIII和FcγRIV。人的FcγRII基因簇全长为15 kb，包含FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIc三个基因。小鼠有FcγRIIb基因，但是没有FcγRIIa和FcγRIIc基因。人与鼠的 FcγRIIb基因高度同源，区别仅在第一个编码胞内区的内含子大小不同。FcγRIIb是一个单链受体，属于免疫球蛋白超家族成员，由具有与IgG结合位点的胞外区、跨膜区和具有ITIM基序的膜内区组成。FcγRIIb受体胞外区是与配体直接作为位点，为了研究FcγRIIb生物学功能，人们已在原核系统中表达了人、猪、小鼠等不同物种的FcγRIIb，即sFcγRIIb（soluble FcγRIIb，可溶性FcγRIIb）在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定[13-15]，但未见大鼠FcγRIIb膜外区原核表达的相关报道。大鼠体积大于小鼠，操作方便，且当前实验室所用大鼠品系纯、价格便宜，有关分子生物学试剂较多，对抗原反应较为一致，因此本实验对大鼠sFcγRIIb基因进行了克隆、表达。
为得到高效表达的sFcγRIIb 胞外区蛋白并便于纯化，本研究选用pET-17b融合表达载体，目的基因插入载体后，处于T7 强启动子调控之下，选择载体多克隆酶切位点的第一个内切酶Nde I，利用该酶酶切位点中的ATG作为起始密码子，去掉载体自身标签序列，避免将标签加在目的蛋白N端，而将His-tag添加于目的蛋白C端，以利于目的蛋白的高效表达，并便于其亲和纯化。
同表达于原核表达系统中的人[13-15]和猪的sFcγRIIb[16]一样，本实验通过筛选表达菌株，优化诱导温度及时间，尽管在一定程度上提高了FcγRIIb 胞外区蛋白的表达水平，但其表达产物依然以包涵体的形式存在，无法获得可溶性表达。不同于之前对重组蛋白sFcγRIIb采用稀释复性的方法，在本研究中，对包涵体的复性采用了透析复性的方法，这种方法的优点在于避免了复性后的蛋白浓度过低和体积过大，以及随后的浓缩过程，可以小规模地制备实验用的活性重组蛋白sFcγRIIb，且最终回收率与稀释复性相当。经分析，蛋白的理论等电点是8.59，所以选择pH值为7.4的PBS作为复性液，是复性液与蛋白的等电点距离1以上，有利于蛋白的溶解，提高复性后的蛋白回收率。初次抽提的包 涵体含有细菌外膜蛋白和核酸等杂质，利用2 mol/L尿素和1% Triton X-100对包涵体进行反复洗涤，去掉了细菌内大部分杂质及部分目的蛋白，减少了后步的纯化压力，有利于后续的包涵体复性。在复性过程中，我们发现，复性过程中沉淀的出现主要发生在复性液尿素浓度由4 mol/L变换至2 mol/L时，因此我们在含2 mol/L尿素的变性液中加入了0.5 mmol/L GSSG，5 mmol/L GSH和0.5 mol/L的精氨酸[13]，并且采用较小的体积比（复性蛋白溶液 : 复性液=1 : 1）并多次换液的方法，有效地减少了沉淀的生成，提高了复性效率。经计算机软件分析，蛋白的疏水性较高，沉淀的产生可能与之有关。
本实验中采用3种不同ELISA实验鉴定重组蛋白的生物学活性，首先将sFcγRIIb或大鼠IgG包被于酶标板上，两种处理均表明两者之间的特异性结合的能力，而将sFcγRIIb与大鼠IgG混合后，同样能够抑制大鼠IgG与包被的sFcγRIIb的结合，3种处理均表明复性后的重组蛋白能够与特异性抗体或大鼠IgG结合，具有正常的生理活性。
4 结论本实验成功克隆大鼠sFcγRIIb基因，建立了sFcγRIIb蛋白原核表达体系，重组蛋白利用Ni-NTA柱亲和层析纯化。包涵体复性后，经Western blotting、ELISA与竞争性ELISA鉴定结果表明，成功制备了具有生物学功能的重组大鼠sFcγRIIb蛋白。
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