地球陆地面积中有很多地区要长期或阶段性的经受零下低温，低温冷冻是分布于这些地区植物所要经受的一种主要环境胁迫。经过长期的进化，很多植物已产生了适应长期或阶段性低温环境的生理机制。有关植物耐冷抗冻机理的研究现已积累了很多资料。例如，人们不仅了解到很多冷诱导基因、抗冻蛋白以及它们发挥作用的机理，还认识了启动冷诱导基因表达的信号转导途径主要有依赖ABA和不依赖ABA（即ICE1-CBF途径）两条，而且，冷诱导基因的表达存在着转录、转录后、翻译和翻译后等多个环节的调节^[1-3]。在这些冷反应机制中，有关碳代谢、光合作用和生物膜脂类等的变化一直是人们关注的重点。

叶绿体（chloroplast）既是植物细胞进行光合作用的重要细胞器，还是蛋白质、DNA、RNA、脂类、四吡咯化合物、萜类和酚类等多种物质合成的场所，它在植物体乃至整个生物界的物质和能量代谢中都发挥着举足轻重的作用。然而，很多环境因素（如低温、干旱等）对叶绿体的生理活动都有影响，并由此进一步影响着植物体的生命活动。大量研究结果也显示，叶绿体是植物细胞中对低温最为敏感的结构之一^[4-7]，所以，研究冬季植物的叶及其叶绿体的生理生化变化对于阐明叶的低温反应特性和抗寒机理以及作物抗低温育种等都有重要意义，在解决农林生产实际问题上也有广泛的应用价值。但是，迄今尚缺少针对叶绿体低温反应与损伤方面的综述，本文对该领域的研究资料进行梳理，以期为该方向的深入研究理清思路。

1 低温对植物细胞叶绿体的伤害

高等植物细胞的叶绿体多沿细胞膜内侧排布，其大小和数量常因物种不同而异，但其结构在常温下却是相对稳定的，多呈椭圆形，表面光滑，有的外膜上有向外突起形成的小泡，其内基粒片层紧密垛叠，排列整齐，结构完整。而低温常引起叶绿体形态结构和功能等方面的损害^{[6, 7]}。多数重要的一年生农作物如水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、棉花（Gossypium hirsutum）、黄瓜（Cucumis sativus）和番茄等都是冷敏性的，当它们处于10 ℃ 以下低温时，植株会不同程度地受到伤害，电镜观察发现，番茄幼苗经5 ℃ 处理2 h，其子叶细胞内的叶绿体被膜及类囊体膜即发生断裂；棉花、黄瓜经低温后，细胞内叶绿体多整体变圆或成弓形，其被膜受损，严重时会变得模糊不清，有些叶绿体甚至解体或几个变态叶绿体相互粘连堆叠在一起，其内基粒的类囊体数目显著减少，排列紊乱，甚至完全消失。伴随着叶绿体形态的改变，叶片的光合速率显著降低^{[8, 9]}。落叶木本植物（如构树，paper mulberry）若经较长时间冷胁迫时（4 ℃ 、48 h），叶边缘即开始枯萎，而其细胞的原生质膜发生内陷，叶绿体形状逐渐由原来的梭形膨胀为纺锤形或椭圆形，膜性结构明显损伤，类囊体堆积很少，典型的基粒消失^[7]。而当越冬植物在超过其叶细胞耐受的低温及冻融循环时，其叶绿体被膜也常遭损坏、内陷破裂，基粒松散至排列紊乱，甚至整个叶绿体破裂解体^{[5, 10]}。我们的实验发现，茶叶细胞的叶绿体在1 - 25 ℃ 下，形态基本上无变化，但经-20 ℃ 低温处理2 h后，即发生断裂和空泡化（资料尚未发表）。低温可引起植物细胞叶绿体形态结构的改变，这一特点已成为人们比较普遍接受的评定植物抗寒性的一个重要指标。

大量实验证明，低温常引起植物细胞的膜结构发生相变，膜上产生龟裂，导致细胞内的区隔化削弱甚至消失，引起其功能障碍或代谢紊乱。由于叶绿体内有大量的类囊体，使其成为细胞内易受低温伤害的结构，如黄瓜和番茄在5 ℃ 时光合速率明显下降；菠菜在遭受冻害时，其叶绿体膜结构的半透性消失，光合磷酸化解偶联。叶绿体对低温敏感的另一个更重要原因是其很多蛋白质对低温敏感，例如：（1）经5 ℃ 处理的番茄幼苗叶细胞中，伴随其叶绿体被膜和类囊体膜的断裂，其类囊体膜上的Mg²⁺-ATP酶活性明显减弱；遭受冻害的菠菜其类囊体膜上的偶联因子（CF₁）、捕光天线LHCⅡ蛋白、33 kD锰稳定蛋白和反应中心D1蛋白等大量减少或解离，导致其不能有效地吸收和利用光能^{[6, 11]}；水稻寒害胁迫时几种蛋白降解加剧，尤其是光合蛋白，如Rubisco的大亚基^[12]。（2）很多叶绿体蛋白[如光系统Ⅰ和光系统Ⅱ（PSⅠ和PSⅡ）、捕光天线LHCⅡ蛋白和Rubisco等]编码基因的表达也易被低温抑制，造成其光合酶的减少、活性显著降低和修复障碍，致使其光合作用活性下降^[13]。Rubisco的活性与RuBP再生能力和CO₂的同化速率密切相关，其酶蛋白的两种亚基分别由叶绿体基因和核基因编码。实验显示，油菜（Brassica napus）的Rubi-sco小亚基蛋白基因的表达和蛋白丰度在冷胁迫后都被下调。而且，叶绿体自身编码蛋白对低温的敏感性比核编码的叶绿体蛋白的低温敏感性要高^{[14, 15]}。（3）Dutta等^[4]还发现，低温胁迫时，由ATP驱动的Rubisco小亚基蛋白前体（PRSS）是由ATP驱动的输入质体的速率被下调了，而且该过程是由于叶绿体的被膜蛋白Tic110和Tic40功能下调所致。

综上所述，叶绿体的寒冻损伤可能首先损害的是叶绿体的膜结构（包括类囊体膜），并使膜上的功能性蛋白质发生构型改变，引起酶活性降低，并使整个细胞内的ATP含量急剧减少，从而降低其生物合成速率，引起细胞生理功能紊乱。若寒冻伤害时间较短，伤害是可逆的，反之，随破坏程度的加深会导致死亡。

2 植物细胞叶绿体对低温的适应性反应

越冬植物在经受低温驯化后，都能增强其耐冻性。经过大量的研究，人们对越冬草本和常绿木本植物叶及叶绿体的冷适应反应已有所认识，可归纳如下：（1）越冬叶片的重要生理特征是其生物膜中不饱和脂肪酸的含量增加，使其在低温下仍可保持液晶态而行使其正常生理功能，使细胞的区域分隔在所要求范围内得到保持。多不饱和脂肪酸（如三烯脂肪酸：16 ∶ 3/18 ∶ 3）含量的多寡与不同品种的抗冻性及其低温下光抑制的程度和恢复速度密切相关^{[16, 17]}。在光合膜中，膜脂（约占膜干重的50%左右）的组成明显地不同于细胞膜、液泡膜等其他膜结构，而以糖脂含量最多，约为膜脂总量的70%（摩尔百分比）以上。光合膜中的糖脂主要为双半乳糖二酰基甘油（DGDG）和单半乳糖二酰基甘油（MGDG）。当含多不饱和脂肪酸链（如亚麻酸）时可使MGDG和DGDG的相变温度分别降为-30 ℃ 和-50 ℃ 。由于膜相变会导致镶嵌于脂质中的蛋白质构象变化，引起膜上一些酶系统功能的变化，因此，类囊体膜的稳定性不仅决定逆境中植物的光合效率，还具有逆境信号的放大作用。人们对拟南芥的Fad7和Fad8基因（编码两种叶绿体脂肪酸去饱和酶）的实验研究早已证明了生物膜的液晶态对于植物在零下低温环境中的生存是至关重要的，而其脂组分中亚麻酸优先累积似乎是抗寒植物之所以具有较高抗寒力的普遍机制之一^[18-20]。（2）植物经冷驯化后，膜脂组分除不饱和度的增加外，并伴有膜上蛋白质种类和含量的变化，其中类囊体的脂类/蛋白质比率在冷驯化后升高，而类囊体膜中还有一些典型的冷诱导蛋白已被证明在叶绿体的冷适应中发挥着重要作用。例如：耐冷植物叶绿体的H⁺-ATPase都保持着较高活性，从而保证叶绿体中有充足的ATP供应，使叶绿体编码蛋白的合成和核编码类囊体蛋白的转入和定位组装等过程能够顺利完成；组成光系统I（PSI）的PSI-E和PSI-N亚基、光系统Ⅱ（PSⅡ）的D1和D2蛋白、两个PsbP家族蛋白（29.8 kD和20 kD蛋白）和质体蓝素（PC）分子等在低温下更换速率加快，从而保证电子流动的顺利进行，增进植物对低温的适应^{[15, 21]}。（3）脱水素具有高度的亲水性和热稳定性，在低温胁迫时，它们积累在膜下像粘胶拉链一样结合于大分子表面，以保护大分子的结构和活性，还可使失活的酶类恢复活性，从而对膜及其镶嵌蛋白活性的维持也有十分重要的作用^{[22, 23]}；最近，Singh等^[24]研究发现，广泛存在于从蓝细菌到植物叶绿体中的一个与抗逆性和抗病性相关的大蛋白家族——原纤维蛋白[Fibrillins，与光系统Ⅱ捕光色素复合体和质体球滴结构（Plastoglobules）结合在一起]是多种胁迫（低温、光氧化、干旱和渗透）抗性所必需的成分，可保持质体球滴结构的完整性和光合结构的稳定性。E. PSⅡ Z蛋白的减少会导致活性天线减少，使流向PSⅡ的电子减少，从而减轻光合电子传递链的氧化压力，这是低温时通过降低Z蛋白基因的表达量来实现的^[15]。在茶叶等植物中存在着叶绿体发育和形态建成响应低温的白化叶现象（如白茶和小麦的白化苗等）是这类形态学上的典型例证。另外，Ndong等^[25]发现了一组存在于禾谷类作物叶绿体基质中的晚成熟蛋白（LEA）3-L1、（LEA）3-L2和（LEA）3-L3是WCS19的同源物，其中的（LEA）3-L2与不同小麦（Triticum aestivum）和黑麦（Secale cereale）栽培种抗冻性的增强相关；还发现若用Wcs19基因转化拟南芥，可使转基因植株的抗冻性显著增强。（3）保持自由基的代谢平衡是叶绿体适应低温的重要机制。植物的叶绿体、线粒体和过氧化物酶体在生命活动中都会产生超氧化物与过氧化氢等活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），尤其是当植物处在自然界广泛存在的各种逆境条件都会导致植物体内ROS代谢失衡，数量增加。由于低温条件下植物所接收的光能超出其光化学同化能力，叶绿体就成了植物细胞ROS产生的主要场所。所以，冷敏感植物和未经冷驯化的耐冷植物的PSⅡ的D1和D2蛋白在低温侵袭时易遭光氧化损伤。而经冷驯化后的抗冻植物改变了基因的表达模式，引发了体内的一系列光保护反应，从光能的吸收（活性天线减少）、电子的传递（细胞色素b6f复合体、PC等活性的调节和电子传递链更换速率的加快）、过剩还原力的耗散等多个环节来增强植物的冷适应，减少ROS产生的量。而一旦ROS产生的量增多，还可激活“苹果酸阀”，将过量的还原力转移到细胞质中利用^{[26, 27]}。

尽管光保护的方式多种多样，而清除自由基的酶[如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（CAT）和过氧化物酶（POD）]和抗氧化剂（如抗坏血酸、谷胱甘肽、类胡萝卜素和维生素E等）等也是其非常关键的防线^{[26, 28]}。在一个成熟的叶肉细胞中，大约有30% - 40%的抗坏血酸（ASA），1 0 % -5 0%的谷光甘肤（GSH），全部的维生素E（VE）及全部的类胡萝卜素（CAR）都存在于叶绿体中。在叶绿体基质中，ASA浓度可高达50 mmol/L，GSH可达10 mmol/L；在类囊体膜上，VE与叶绿素分子的比值约为1 ∶ 24，用以防护膜系统成分的氧化，VE的高脂溶性还能增强膜流动性，从而提高PSⅡ的光化学活性。ASA不仅是ROS清除剂，还可偶联产生跨膜△pH，促进叶黄素循环。叶绿体中含有大量的VC和GSH，对H₂O₂和O^2-的清除有重要作用。玉米等一些植物对冷害的抵抗能力较差，原因之一就是清除活性氧的机制较差。耐冷植物的叶绿体可使ROS浓度保持在较低水平，对茶树的研究发现，抗冻性强的品种超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性在低温时能维持较高的水平；过氧化物酶同工酶总活性及谱带数量明显强于和多于抗性弱的品种^{[15, 24, 29, 30]}。

3 叶绿体在植物冷驯化反应中发挥重要作用

高等植物的叶绿体含有3 000多种蛋白质，绝大多数是由核基因编码的^[31]。叶绿体对环境变化的适应可反应在相应核基因的表达水平上，而质体到核的信号转导调节着这类基因的表达。在冷驯化过程中，植物抗冻性的发展与其光合作用活性密切相关。植物能感知日长、光质和光照强度。叶绿体既以日光作为能源，并可通过调节代谢来适应电子传递链的氧化还原状态，并由此适应光照强度的变化^[32]。PSⅡ激发压的增加是冷调节基因表达的原初刺激，因此，暴露于冷环境时如果没有光照也会降低很多冷调节基因的诱导^{[31, 33]}。同样，一些与冷驯化相关的形态学特征（如冬季谷物紧凑莲座的生长习性的发展）是依赖PSⅡ激发压的^[34]。当拟南芥和其他植物在黑暗、低光强度、或在正常光强度但有光合作用抑制剂3-（3 ，4- 二氯苯基）-1-二甲基脲存在的条件下冷驯化时检测不到抗冻性的增加^[35]。Svensson等^[36]通过利用基因芯片技术对大麦（Hordeum vulgare）叶绿体发育缺陷突变体的转录组分析，发现仅有11％的冷调节基因是不依赖叶绿体的，这类基因主要包括很多CBF（C-repeat binding factor）控制的基因；而大约67％的冷调节基因是依赖叶绿体的，从而证明叶绿体在控制植物的冷驯化中发挥着主要作用。

在低温条件下，叶绿体的光合能力降低，导致其ROS的积累。ROS是植物体内重要的信号分子，可作为第二信使引发叶绿体到细胞核的信号反馈，并改变很多基因的表达模式，使其光合作用活性和细胞代谢达到平衡状态。这说明光合电子传递链（photosynthetic electron transport chain，PET）的任何平衡失调都会导致氧化还原作用的失衡，植物体由此通过叶绿体来实现感知环境温度的降低，产生质体到细胞核信号转导^[3]。因此，涉及PET蛋白（如FtsHs和Deg蛋白酶）的核基因突变都会导致氧化还原失衡和发育异常。叶绿体基因的表达状态充当着另一个PET平衡的检验点，很多基因（如Wcs19和早期光诱导蛋白基因等）的表达影响着PSⅡ的激发压和PET的平衡^{[25, 27]}。Lepage等^[6]对拟南芥的研究表明，质体基因组的不稳定会导致活性氧产生和质体到细胞核的信息反馈。叶绿体基质中NADP/NADPH的比率是其氧化还原电位的反映^{[24, 26, 37, 38]}。除叶绿体的光合组件和其他分子的氧化还原状态等引起活性氧的积累信号外，人们还认识到叶绿素生物合成的中间体（如四吡咯类化合物）和糖的积累等都可以提供核编码的质体蛋白和非质体蛋白基因表达调节的信号^{[31, 32, 39]}。

4 结语

叶绿体不仅是植物细胞中对低温非常敏感的细胞器，易受冷冻伤害，它在植物细胞的低温信号感受和转导中也发挥着很重要的作用。目前，有关叶绿体的低温伤害、适应性反应和参与的低温信号转导还远未阐明。而这一领域的研究有着诱人的前景，故有人畅想，操纵光保护反应将提高植物的光合作用，这会给农林业生产带来巨大的效益^{[26, 38, 40]}。