栽培花生（Arachis hypogaea L.）作为一种重要的油料作物和经济作物，具有重要的经济价值和营养价值。2015年我国花生的总产量达1 670万t，居世界首位。但是一些生物及非生物胁迫会影响花生的产量和品质，如干旱、盐碱、低温、寒冷、高温及各种病原菌等外界不良环境会延缓植物的生长发育，降低植物的生产效率，甚至在极端条件下，会导致植物死亡。植物的应激反应是动态的，涉及到不同调节水平之间错综复杂的关系，包括新陈代谢的调节、生理上基因表达的调节和形态上的适应等^[1]。使用寄主抗性是控制植物病害最有效、经济的方式^[2]。

有研究表明，抗病基因（R基因）在识别和抵御病原菌入侵方面具有重要作用。编码具有核苷酸结合位点（NBS）和C-末端富含亮氨酸重复（LRR）的基因，是R基因中最大一类抗性基因^[3]。植物NBS-LRR蛋白（nucleotide-binding site-leucine rich re-peat protein）根据氨基酸末端序列可分为两类，卷曲螺旋（CC）- NBS-LRR类蛋白质和TIR-NBS-LRR类蛋白，后一类蛋白在单子叶植物中尚未被鉴别^{[4, 5]}，而且TIR-NBS-LRR类蛋白可能比CC-NBS-LRR型蛋白起源更早^[6]。抗逆性反应的识别过程是基于NBS-LRR蛋白介导的直接或间接的识别病理分子——无毒蛋白AVR进行的，而AVR蛋白突变会使抗逆性反应过程中识别异常，从而导致抗性异常。也有研究表明，抗性反应的识别过程是通过NBS-LRR蛋白与转录因子的相互作用进行的，Shen 等^[7]的研究表明，在大麦中识别白粉病抗性蛋白（Mla10）是通过CC结构域与一个WRKY转录因子结构域的相互作用，进行防御反应。NBS结构域位于NBS-LRR型蛋白的中间区域，存在于真核生物具有结合ATP和GTP的许多蛋白质之中，如ATP合成酶β亚基、核糖体延伸子、腺苷酸激酶以及抗病基因编码蛋白等。NBS结构域可以与核苷酸进行结合，LRR结构域在将感知到的病原体激活方面起着至关重要的作用^[8-10]。

花生作为豆科植物家族中的一个重要成员，其NBS-LRR类基因在不同胁迫下的功能分析报道尚不多见。本研究以花生抗逆性基因AhNDrp为研究对象，以本课题组此前获得的花生根转录组测序数据为依据^[11]，从基因注释结果中筛选到contig281453为花生抗逆性蛋白，获得基因的半长序列，利用电子克隆技术获得AhNDrp全长基因，从而分析该基因在花生不同组织部位（根、茎、叶、幼胚）的表达情况以及干旱和黄曲霉胁迫下的表达特性，旨在为花生抗黄曲霉的机理研究提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验材料与处理

供试花生栽培品种白沙1016，由山东省花生研究所提供。花生根、茎、叶取自2周龄的组培苗，幼胚子叶为收集果针入土后25-55 d不同大小的花生荚果，剥皮后混合。所有植物材料取样后于液氮中迅速冷冻，在-80℃冰箱保存。

干旱处理：当花生生长至15 d左右时，选择健壮且长势一致的幼苗，用15% PEG6000溶液模拟干旱处理，分别取未处理及处理后2、4、6和8 h的幼苗根，液氮速冻后于-80℃保存，用于总RNA提取和荧光定量PCR分析。试验设3次重复。

黄曲霉处理：花生剥去种皮后种植于温室中，3周后接种黄曲霉孢子。用无菌水收集在PDA培养基上培养2-3 d 的黄曲霉菌孢子，调整孢子浓度为6×10⁸/ mL^[12]，喷于花生的根部，分别取未处理及处理后 1、3、5和7 d的幼苗根，液氮速冻后，于-80℃保存，用于荧光定量PCR分析。试验设3次重复。

1.1.2 酶及主要试剂

Primer Star高保真聚合酶购自TaKaRa公司；2×Taq Mix PCR扩增试剂购自北京博迈得生物技术有限公司；pMD19-T Vector购自TaKaRa公司；DNA Marker DL2000分子量标准购自Promega公司；其他试剂均为国产分析纯产品。PCR 产物测序由北京华大生物技术有限公司完成。反转录和荧光定量PCR试剂盒为北京天根公司FastQuant cDNA第一链合成试剂盒和SYBR Green荧光定量试剂盒。

1.1.3 PCR引物

引物的合成由上海生工生物技术有限公司完成，引物序列见表 1。

1.1.4 生物信息学数据库和软件

花生基因组网址（http://peanutbase.org）；序列检索采用NCBI blast（http://www.ncbi.nlm.Nih.gcv/blast）；蛋白保守结构域分析在（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行；三级结构预测在（http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1）进行；氨基酸同源性比对分析采用DNAMAN软件；系统发育树构建采用MEGA4.0软件。

1.2 方法 1.2.1 花生基因组的提取

花生基因组DNA的提取采用改良的CTAB法^[13]。将提取基因组放于-20℃储存备用。

1.2.2 NBS-LRR类基因全长获得

根据peanutDB上序列，设计引物见序列表 1。以花生栽培品种白沙1016基因组为模板，AhNDrp-f和AhNDrp-r为引物进行PCR扩增。PCR 扩增程序为：94℃ 10 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min。取PCR产物电泳，选取目的条带，回收、克隆到 pMD19-T Vector，经 PCR 鉴定正确后进行测序拼接。

1.2.3 RNA的提取、cDNA第一链的合成

RNA的提取 采用上海生工生物工程有限公司TRIzol试剂，提取方法参见说明书。TaKaRa公司的DNaseⅠ用于消化残留 DNA，cDNA 第一条链的合成用天根的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒。

1.2.4 花生AhNDrp的mRNA转录分析

分别提取花生2周龄的根、茎、叶和不同生长时期混合幼胚的总RNA及干旱和黄曲霉接种处理下不同时期的花生根总RNA，反转录成cDNA，进行AhNDrp基因表达特性分析。用天根公司的SYBR Green荧光定量试剂盒检测花生AhNDrp基因的表达量。设actin基因为内部参照，AhNDrp-real-time-f和AhNDrp-real-time-r分别为扩增目的基因的上下游引物。PCR 扩增程序为：95℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环。

2 结果 2.1 AhNDrp全长基因的获得与序列分析

本实验室经转录组测序，获得一条1 970 bp的EST序列（contig281453），在NCBI上进行比对，注释为NBS-LRR型抗逆性蛋白（NBS-LRR type disease resistance protein）。将该序列与http://peanutbase.org网站上公布的花生基因组序列进行比对，根据比对结果设计引物（AhNDrp-f/r），以花生基因组为模板，扩增得到3 200 bp的片段（图 1），送测序。在NCBI数据库中进行相似性比较，该蛋白与大豆抗逆性蛋白（Glycine soja disease resistance protein RPM1，GenBank No：KHN40407.1）的相似性最高为79%。将该基因命名为AhNDrp基因，编码区为2 832 bp，GenBank登录号为KU128398。AhNDrp基因DNA序列与cDNA序列比对分析发现，AhNDrp基因DNA序列中不包含内含子，编码943个氨基酸，终止密码子为TAG（图 2）。

2.2 AhNDrp蛋白的生物信息学分析 2.2.1 AhNDrp蛋白的保守结构域分析及三维结构预测

使用CDD（conserved domain database）在线数据库进行蛋白功能结构域的预测，发现AhNDrp蛋白有5个典型的抗逆性蛋白保守结构域（图 3）。其中DomainⅠ为RX-CC-like结构域，位于2-127区，与抗病反应的必要因素RanGAP2相互作用；DomainⅡ为AAA-ATP酶结构域，由117个氨基酸组成，包含一个P-Loop（NBS结构域中的保守基序）元件；DomainⅤ位于595-804区，由209个氨基酸组成，是富含亮氨酸重复序列，LRR基序可参加蛋白-蛋白互作，在分子识别过程中发挥重要的作用。这3个保守区域说明AhNDrp属于NBS-LRR型抗逆性蛋白。

利用同源建模的分析工具SWISS-MODEL对花生NDrp蛋白结构域进行三维结预测。软件自动选择PDB数据库中的2qkwB作为模板，对目标蛋白的605-879氨基酸进行3-D结构预测，如图 4所示，蛋白的胞内结构域是由132个α-螺旋、65个无规则卷曲、52个延伸链和26个β-折叠连接共同构成的复杂结构。

2.2.2 AhNDrp蛋白同源性分析

将AhNDrp蛋白序列与豆科植物花生、大豆、野生大豆、鹰嘴豆、菜豆（Phaseolus vulgaris，XP_007158209.1）、苜蓿（Medicago truncatula，AF491998.1）和非豆科植物白梨（P.×bretschneideri，XP_009373508.1）、苹果（Malus domestica，XP_008342592.1）、蔷薇科落叶乔木植物梅（Prunus mume，XP_008238133.1）、可可（Theobroma cacao，XP_007040756.1）、川桑（Morus notabilis，XP_010110397.1）的抗逆性蛋白序列进行多重比对，并构建系统发育树（图 5）。白沙1016号花生AhNDrp蛋白与白梨和苹果的进化关系最近；苜蓿和菜豆等次之；与鹰嘴豆、梅的进化关系最远。

2.3 AhNDrp基因在干旱和黄曲霉处理下的表达特性分析

通过荧光定量PCR方法分析花生品种BS1016中AhNDrp基因的表达情况，结果（图 6-A）显示AhNDrp基因在茎、叶、幼胚中均无表达，仅在根中特异表达。用15% PEG6000溶液模拟干旱胁迫处理，分析0-8 h AhNDrp基因在花生根中的表达量（图 6-B），发现随着干旱处理时间的增加AhNDrp基因表达量也逐渐上升，在处理6 h时表达量最高，处理8 h时表达量降低，但该基因在干旱处理下的表达量始终低于未处理时的植株，说明AhNDrp基因无抗干旱能力。用孢子浓度为6×10⁸/mL的黄曲霉处理花生后，0-3 d，AhNDrp基因的表达量处于上升阶段，在3 d达到最高表达量，为对照表达量的1.62倍；之后开始下降，在第7天时表达量降到最低，明显低于对照组及其他处理组（图 6-C）。

3 讨论

目前花生基因组测序已经取得重要进展，部分基因组已公布（http://peanutbase.org），为花生新基因克隆及基因功能研究等提供了数据平台。本实验室通过对花生根、叶及未成熟种子的转录组深度测序，构建了含3万多条花生EST序列的数据库。本研究结合转录组数据和基因组测序，成功克隆到了花生AhNDrp全长基因，并利用生物信息学方法对该抗逆性蛋白结构和功能进行了预测，为后续探究花生抗逆性基因的表达调控和作用机制提供参考。

有报道指出，NBS-LRR类基因是在进化过程中通过串联或部分复制祖先基因而得到的。NBS结构域包含几个保守基序：P-loop、kinase 2a、kinase 3a 和GLPL motifs等^[14]；P-loop被证明在ATP结合能力中起到关键作用^[10]，在烟草^[15]和拟南芥^[16]PR5中也得到类似结论；kinase-3a激酶可以结合嘌呤或核糖^[14]，但是NBS结构域在植物抗病性机制中的作用尚不清楚。LRR结构域在蛋白与蛋白之间的相互作用中发挥重要作用，最新研究结果表明LRR蛋白片段足以启动防御信号^[17]，是识别病原体衍生的效应分子，随后激活宿主防御反应。LRR蛋白的多种结构域使其可以同时作为病原体探测器、传感器、开关和响应因子^[18]。这些NBS-LRR类蛋白质在细胞生长、风化、细胞骨架的形成、囊泡运输和防御反应中起重要作用。目前，已从不同植物中克隆得到一些NBS-LRR类基因，例如，何利等^[19]从桑树中克隆到5个NBS类基因分别为CL93、Unigene14278、Unigene26173、Unigene32704、Unigene31320的片段；史静东等^[20]利用同源序列法分离小麦NBS-LRR类抗病基因类似片段，获得4个RGAs片段。本研究利用电子克隆的方法，克隆得到的基因全长2 832 bp，命名为AhNDrp基因，含有NBS-LRR类抗病基因典型的保守结构域。

刘建成等^[21]从草莓中克隆得到一个NBS-LRR类基因，经半定量 RT-PCR 分析显示，该基因在草莓的所有组织中都表达，但在茎尖分生组织中表达水平最高，且在叶中的表达水平明显受到外源水杨酸和脱落酸处理的影响。本研究中克隆的AhNDrp基因只在花生根部特异性表达，与前期转录组测序结果及半定量RT-PCR的结果一致。赵小波等^[22]在花生抗旱品种中克隆到NBS-LRR类PDR1基因，该基因在干旱胁迫处理12 h 后表达量达到峰值。但本研究中，干旱处理后AhNDrp基因的表达量始终低于未处理时的植株，说明该基因的表达产物不参与干旱胁迫的响应，被迫应答干旱胁迫。

刘宇等^[23]克隆到花生抗病基因，并测得在黄曲霉侵染后，种皮、籽仁及果皮中基因PnAG3的表达量都上升。而经黄曲霉胁迫后，AhNDrp基因在0-3 d中表达量持续上升，说明该基因可能参与了黄曲霉抗病反应过程。

NBS-LRR类基因是一类抗逆性基因，黄曲霉是一种致病性真菌，而在干旱胁迫下，黄曲霉菌株可能成为土壤中的优势菌株，导致花生黄曲霉毒素污染、品质下降等。所以测定AhNDrp基因在干旱和黄曲霉胁迫下的表达量，为在理想遗传背景下引进高效抗病基因的育种工作提供一定的参考。

4 结论

本研究克隆了花生AhNDrp基因的全长序列，含有NBS-LRR保守结构域，该基因在花生根部特异表达，并根据实时荧光定量PCR结果，推测其可能参与黄曲霉胁迫响应。