植物开花是植物生长发育的一个重要过程^[1]。植物响应并整合环境和内源信号，产生相应的反应信号，然后以网络应答的方式将新信号传递给开花整合因子，再由其促进开花基因LEAFY（LFY）和APETALA1（AP1）表达，最终促使植物开花^{[2, 3]}。AP1对控制植物花分生组织特性与花器官形成具有重要的作用^{[4, 5]}，属于MADS-box基因家族^{[6, 7]}。在大豆^[8]、苹果^[9]、百合^[10]、樱桃^[11]、建兰^[12]和杨树^[13]等多种植物中已分别克隆出AP1同源基因。异位表达各种植物的AP1基因，均促进拟南芥或烟草开花，且此性状可遗传到子代^[14]。

大豆（Glycine max）起源于中国，是植物性蛋白的主要来源和重要的工业原料^[15]。大豆开花影响籽粒产量，对高产育种具有重要作用^[16]。传统方法通过人工调控（控制光照、改变温度、使用激素等）花期，而转基因技术较多集中于大豆抗病虫害、抗逆性及大豆油分等方面研究^[17]，应用转基因控制大豆开花从而提高产量方面研究较少。采用分子遗传学和分子生物学改良品种，将促进开花的AP1基因导入短日照植物中，改变植物开花对短日照的依赖，促进开花，提高产量，可加快育种进程。大豆基因组具有多拷贝特征，AP1同源基因有4个拷贝^[18]，本研究以其中一个APETAL1（GmAP1）同源基因为目标，利用植物遗传转化技术将该基因转入到拟南芥中，对其功能进行初步分析，探讨其功能与大豆花发育的关系，为进一步研究大豆花发育的分子机理提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

实验中植物材料为大豆品种天隆1号，种植于中国农业科学院作物科学研究所人工气候室（16 h光照，8 h黑暗，25℃），开花期取花蕾，提取RNA，用于基因克隆，分别取花蕾的花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊，提取RNA，用于表达分析。拟南芥（Arabidopsis thaliana）为Columbia（Col-0）生态型背景。拟南芥突变体ap1.3由中国科学院植物研究所孟征研究员惠赠。大肠杆菌DH5α，农杆菌GV3101，载体Fu76-35S、Fu28和Fu39-2^[19]均由本实验室保存备用。实验所用的高保真DNA聚合酶，反转录试剂盒、质粒提取试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒分别购自TaKaRa公司、博迈德生物公司和天根生物技术公司。实验用引物由华大科技公司合成，序列测定由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。

1.2 方法 1.2.1 AP1克隆及表达载体构建

根据Phytozome数据库中Glycine max Wm82.a2.v1预测基因序列，设计引物（表 1）扩增GmAP1基因的编码序列，根据北京全式金生物技术有限公司RNA提取试剂盒提取天隆1号RNA，反转录反应总体积10 μL：5× PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，总RNA 1 μL（500 ng/μL）用RNase Free H₂O补足至10 μL。通过37℃ 15 min，85℃ 5 s，完成反转录反应。PCR体系：2×PrimeSTAR GC Buffer 25 μL，dNTP Mixture 4 μL，正反向引物各1 μL（10 μmol/L），模板5 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，用灭菌水补足至50 μL。PCR反应程序为：94℃ 3 min；98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min/kb，循环35次；72℃ 7 min。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。回收PCR产物，与Fu28载体连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定阳性克隆。阳性克隆委托北京睿博兴科生物技术有限公司测序，序列测序正确的质粒通过LR反应到表达载体Fu39-2，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定阳性克隆。阳性克隆委托北京睿博兴科生物技术有限公司测序，最后转化农杆菌GV3101，农杆菌花浸染法转化拟南芥。

1.2.2 实时定量RT-PCR

在转录本序列设计实时定量PCR特异引物（表 1），扩增长度113 bp。PCR产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，通过菌落PCR鉴定阳性克隆，委托北京睿博兴科生物技术有限公司测序，序列与扩增序列完全匹配。实时定量PCR的反应体系：SYBP Premix Ex Taq 7.5 μL，ROX reference Dye 0.3 μL，正反引物各1.5 μL（2 μmol/L），cDNA 1.5 μL（RNA 325 ng），用超纯水补足15 μL。生物重复3次。实时定量PCR反应程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。以ACT11为内参基因，超纯水作模板为阴性对照，采用2-△△Ct法计算相对表达量。

2 结果 2.1 GmAP1编码蛋白聚类分析及其序列特征

分析表明GmAP1（基因序列号：Glyma08g36380）编码236个氨基酸（图 1），其中包含MADS-box结构域和K-box结构域（图 2），属于MADS-box基因家族成员。经Blast进行同源序列比对，GmAP1氨基酸序列与豇豆（Vigna unguiculata）、百脉根（Lotus japonicus）、鸡豆（Cicer arietinum）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、豌豆（Pisum sativum）、红豆（Vigna angularis）和大枣（Ziziphus jujuba）等物种中的AP1或AP1-like的同源性达到80%以上（图 3）。其中MADS-box结构域和K-box结构域高度保守，C-末端以CF结尾，而不是以法尼基转移酶的识别位点CFAA结尾。

2.2 大豆GmAP1 cDNA全长的获得

以拟南芥APETALA1（AP1）基因为参照，根据Phytozome数据库中大豆基因组Glycine max Wm82.a2.v1序列预测的GmAP1基因序列设计引物，以大豆cDNA为模板进行PCR扩增，得到750 bp左右的特异条带（图 4）。测序结果表明该片段长度为711 bp，与Glycine max Wm82.a2.v1中的预测基因序列相同，且和已报道AP1同源基因的同源性较高，表明该片段是大豆的AP1同源基因。

2.3 GmAP1表达分析

利用实时定量RT-PCR（Real time-PCR）的方法检测GmAP1在大豆不同花器官的表达情况。结果（图 5）表明，在大豆不同花器官中GmAP1的表达有显著差异。GmAP1在萼片中表达量较高，在花瓣中表达量次之，在雄蕊和心皮中也有少量表达量。

2.4 花浸染法转化拟南芥

为进一步分析GmAP1的功能，将由35S启动GmAP1基因的载体转化拟南芥，获得转基因植株，观察p35S∷GmAP1转基因植株和野生型表型。结果（图 6）显示，在长日条件下（16 h光照，8 h黑暗），p35S∷GmAP1转基因植株比野生型植株早花，p35S∷GmAP1转基因植株在播种后13-15 d就开花，此时莲座叶数仅为两片，且株型小，花数量少；而野生型在播种后22-24 d才开花，莲座叶数为9-11片。p35S∷GmAP1转基因植株与野生型的花型不同，拟南芥野生型花有4个花萼，4个花瓣，6个雄蕊，1个雌蕊，而p35S∷GmAP1转基因植株花有4个花萼，8个花瓣，10雄蕊和2个雌蕊（图 7）。

3 讨论

本研究成功克隆得到大豆AP1同源基因GmAP1，其氨基酸序列与许多物种中AP1同源基因编码的氨基酸序列同源性达80%以上，并与豇豆（Vigna unguiculata）、百脉根（Lotus japonicus）、鸡豆（Cicer arietinum）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、豌豆（Pisum sativum）等豆科植物在一个分支上。GmAP1的MADS-box和K结构域相对比较保守，这些结果表明，大豆GmAP1属于MADS-box家族基因。但是，GmAP1蛋白C-末端以CF结尾，而不是以法尼基转移酶的识别位点CFAA结尾。

AP1基因属于A类基因^[20]，调控花萼和花瓣的发育^[21-23]。实时定量RT-PCR分析表明，GmAP1在大豆不同花器官中表达量不同，在花萼和花瓣中表达量相对于雄蕊和雌蕊较高。在拟南芥中，AP1同源基因作为花分生组织决定基因，在花原基发育早期阶段发挥作用^{[6, 24]}；作为花器官特异基因，决定花器官起始和发育^{[4, 5]}。不同物种的AP1同源基因异位表达均早花，但花器官结构的改变却不相同。在烟草中过表达大豆Jackson品种的AP1-like基因（Glyma16g13070.1），表现出早花，植株矮小，正常花瓣处出现了雄蕊状的花瓣^[8]。苹果中AP1-like基因MdMADS5过表达使拟南芥早花，花序较短，花蕾不同，尤其是花萼^[9]。在烟草和拟南芥中过表达桦树PsnAP1-1和PsnAP1-2基因，表现出早花，植株矮小，融合终端花，花畸形^[25]。本研究在拟南芥中过表达大豆天隆1号品种的GmAP1基因，植株表现出早花，植株矮小，花数量少，花器官（花瓣、雄蕊和雌蕊）数增多。因此，GmAP1基因对大豆开花时间及花器官的形成可能有重要作用。

大豆AP1基因是多拷贝基因^[18]，Chi等^[8]在烟草中过表达大豆Jackson品种的AP1-like基因，表现出早花，植株矮小，正常花瓣处出现了雄蕊状的花瓣。本研究以另一个AP1同源基因为目标，对该基因进行表达分析，以及在拟南芥中过表达该基因进行初步的功能分析，与Chi等早花结果一致，但花器官结构的改变不同。结果说明，大豆中不同GmAP1基因拷贝的功能并不完全相同，它们在进化过程中发生了功能的分化。对这两个GmAP1基因进行比较研究分析，将进一步解析它们在功能上的协作与特化机制。

4 结论

本研究克隆获得大豆天隆1号GmAP1基因，并证实该基因参与大豆开花时间以及花器官形态建成的调控。