核移植技术是创建基因完全相同的个体的过程（即为克隆），包括卵母细胞的成熟，供体细胞的分离和处理，重构胚的人工激活，胚胎培养和胚胎移植等过程。自从2000年获得首例体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）克隆猪^[1]，这项技术发展迅速，在许多实验室里都成功获得了不同供体细胞来源的克隆猪。但是由于在猪物种上还没有建立起严格意义上胚胎干细胞（embryonic stem，ES），猪的基因修饰研究途径有限。获得基因修饰猪的主要方法是在体细胞上进行基因修饰，再进行SCNT^[2-4]。该技术路线先对体细胞进行基因修饰，然后把其作为供体细胞进行核移植，这样可以保证获得基因修饰动物，且不存在嵌合体问题。目前大动物获得基因修饰大动物主要途径是SCNT。

1 猪的SCNT发展历程

克隆猪的研究发展开始于1989年，Prather等^[5]报道了第一例成功的克隆猪实验，研究者利用4-细胞期卵裂球作为核供体，MⅡ期卵母细胞作为受体细胞，共移植88个胚胎到受体母猪体内并进一步生长发育，但只诞生了一头克隆猪。直到十年后才有类似的胚胎核移植的成功报道^[6]。首例SCNT克隆动物“多莉”绵羊建立后，猪的SCNT研究进展却相对缓慢。由于猪初期胚胎培养技术相对落后，猪卵母细胞对外界应激敏感，人工激活效率低，移植胚胎囊胚发育率低等原因，直至2000年，才有3个研究机构获得了体细胞克隆猪。Polejaeva等^[1]获得了5头健康的体细胞克隆猪。该实验采用了与以往核移植技术不同的新方法，研究者第一次将猪的颗粒层细胞作为供体细胞与无核的卵母细胞融合，18 h后将供体细胞核从第一个卵母细胞中取出，移植到去核的受精卵细胞中。研究人员采用这种双核移植的方法是因为他们猜测在最初的“一步法”中，核移植后的激活过程产生的刺激物不能提供胚胎发育的全部条件。该报道使研究者认识到猪克隆的过程比其他动物复杂和困难得多。但Onishi等^[7]使用显微注射直接将猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts，PFFs）的细胞核注入到无核的卵母细胞中，成功地克隆了一头活的小猪。Onishi的研究证实了二步法的核移植对获得SCNT猪不是必须的。以上两项研究都是采用猪的体内成熟卵母细胞而非体外人工培养的未成熟卵母细胞。因体内成熟的卵母细胞是非常昂贵的，Betthauser等^[8]选择用体外培养的成熟卵母细胞，并系统地优化SCNT的各个步骤，建立了一种重复性很高的方法，通过该实验方案能顺利获得转基因猪。Bondioli等^[9]研究者以体内成熟的卵子为胞质受体，以转基因公猪皮肤成纤维细胞为核供体细胞，构建了299枚的核移植胚胎，获得2头仔猪。Park等^[4]获得了首例通过成纤维细胞基因修饰，再进行核移植的转基因猪。随后Lai等^[10]利用同源重组（homologous recombination，HR）方法在微型猪成纤维细胞中进行GGTA1基因敲除，然后核移植到体外无核成熟卵母细胞中，获得了4头存活的GGTA1基因敲除猪。Walker等^[11]研究用体外成熟的卵母细胞为胞质受体，选择PFFs为核供体，移植重构胚到5头自然发情的受体母猪，其中4头怀孕产仔28头，效率分别为7%、5%、12%和6.6%，总效率为5.5%，优化了实验细节，包括降低了融合液中的钙离子浓度、选用体外成熟时间较短的卵母细胞、调节溶液的渗透压等，但研究没能确定提高了克隆效率的因素^[11]。猪的SCNT技术逐步完善发展。近年来国内多家研究机构也已获得了克隆猪和基因修饰猪。同时多种特有的地方猪品种克隆成功，如版纳微型猪^{[12, 13]}、中国实验用小型猪^[14]、巴马猪^[15]、东北民猪^{[16, 17]}和五指山猪^[18]等。

2 猪的SCNT主要技术环节

SCNT是一项非常复杂的实验操作，其成功与否受到多种因素的影响，包括物种、受体卵子的来源、细胞核供体的细胞类型、核移植前供体细胞的处理、卵母细胞人工激活的方法、胚胎培养、重构胚胎细胞核中体细胞印记的损失和核移植技术的正确操作等。此外，猪的SCNT具有一些独特特征，是至少要有个好的胚胎来诱导和维持妊娠。因此要提高核移植成功的几率，就要在每一步中摸索最适宜的条件。SCNT的主要影响因素包括以下几方面：

2.1 供体细胞

在小鼠的核移植中，有研究测试了8种不同起源、不同的基因背景的雌雄胎儿和成年鼠的细胞类型发现，只有纤维细胞、胚胎性腺和卵丘细胞能成功获得转移基因动物^[19]。许多细胞型在植入宫壁后反复不能发育。在克隆牛方面，有研究测试15种来自不同的基因背景雌雄个体胎儿、新生和成年牛的体细胞供体发现，只能利用卵丘细胞、输卵管细胞、皮肤细胞和肝细胞，才能获得转基因动物^[20]。在克隆猪方面，至少有10种细胞型已经证实了具有完全的克隆能力，如PFFs、卵丘细胞和脂肪原细胞等^[21]。Wei等^[13]比较了PFFs、新生猪成纤维细胞，成年猪成纤维细胞的克隆能力，PFFs和新生猪成纤维细胞卵裂率、囊胚率、怀孕率等均高于成年猪成纤维细胞。现已经证明了很多物种中可用于核移植的供体细胞群体。另一影响因素是供体细胞所处的细胞周期，但在核移植领域对这一问题的看法目前颇有争议。而用于转基因猪的核供体细胞必须具备两个特征，即能够直接发育和具有增殖能力，这样可有选择进行基因修饰。PFFs因具有很强的增生能力，成为早期研究首选的核供体细胞。SCNT面临的问题是供体细胞衰老问题，无足够的生长周期完成基因修饰等操作。近年来发展起来的诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）技术，为没有获得真正ES系的物种提供一种新型的核移植供体细胞。2010年有研究利用小鼠iPSCs通过核移植途径得到克隆小鼠^{[22, 23]}，表明了iPSCs与ES一样具有全能性，可以代替ES来实现对动物基因组的修饰。但是之后一直未能成功诱导并培育出iPS克隆猪。直至2013年中国研究者首次在世界上获得成活的iPS克隆猪^[24]。iPS的出现为大动物基因打靶奠定了技术基础，可以通过嵌合体技术，获得生殖系嵌合的动物，经过交配获得基因修饰动物，同时可将这些基因打靶iPSCs为核供体，通过核移植技术获得基因修饰克隆动物。这项技术将能用于转基因猪的培育，在猪种工程培育，以及再生医学等领域发挥重要的作用。

2.2 卵母细胞

一般认为，体外成熟培养而获得的卵母细胞的发育能力不如体内成熟卵母细胞。最初两项猪的SCNT研究是选择以体内成熟卵母细胞作为核移植胞质受体^{[1, 7]}，但很快以体外成熟卵母细胞作为受体也获得了体细胞克隆猪^[8]。有研究比较了两种来源卵母细胞的差异发现，两者的囊胚率并无显著差异^[25]。在卵母细胞成熟复杂变化过程中，核成熟进程与细胞质成熟相互影响，相互促进^[26]。影响猪卵母细胞体外成熟的因素包括卵母细胞成熟抑制因子、促成熟因子，激素影响、卵泡大小、卵丘细胞形态、卵泡液、体外成熟时间、培养温度及细胞生长因子等。有研究证实猪体外培养胚胎囊胚率比其他畜牧品种低^[27]。通过体内冲卵胚、体外受精、核移植获得的胚胎，经体外培养后检测囊胚细胞数少于体内发育胚胎的囊胚细胞数^[28]。导致出现这些问题的原因可能是由猪体外培养系统仍不完善而引起。有研究显示低氧分压（7% O₂）培养条件下能提高猪孤雌胚胎的囊胚率和囊胚的细胞数，PZM3胚胎培养液与NCSU23相比，能显著提高囊胚细胞数^[14]。用瘦素（Leptin）处理猪卵母细胞及体外受精胚胎发现Leptin能提高卵母细胞成熟及胚胎发育^[29]。

2.3 核移植胚胎的构建

在SCNT中需要对卵母细胞去核。常用去核的化学方法是利用双苯酰亚胺使染色体显影，但这种化合物影响猪卵母细胞发育。因为体外成熟后处于第2次减数分裂中期卵母细胞核通常位于第一极体附件的胞质中，可通过吸走第一极体及附近胞质的方法去核，这种方法称为盲吸去核法，其成功率在85%-90%之间^[30]。近年来研发出了纺锤体观测仪，能利用偏振光的原理，不需染色即可直接观察到减数分裂中期的染色体，从而达到100%去核效率，目前这种去核方法被认为是对卵母细胞损伤最小、效率最高的方法。供体细胞核导入胚胎的方法主要有两种，直接注供体细胞核或是注入完整的供体细胞到卵黄周隙。供体细胞核植入无核卵母细胞中后，重建的胚胎须激活才能继续生长，一般由多种物理的和化学的因素来人工诱导完成。有研究发现在融合后延迟3 h，再进行激活可以提高效率^[31]。Kuhholzer等^[32]报道电刺激的卵母细胞能获得接近20%的囊胚率。潘伟荣等^[33]研究电激活参数对猪卵母细胞孤雌胚胎发育的影响，并优化电激活技术体系。Zhang等^[34]研究表明用血清饥饿法和阿菲迪霉素处理供体细胞能提高重构胚的发育能力。

2.4 胚胎移植

考虑到体外培养可能对核移植胚胎的不利影响，胚胎移植一般选择发育早期阶段的胚胎，在显微操作第2天进行胚胎移植。在怀孕期第12天左右，在猪妊娠期间代孕猪对胚胎的识别需要来自4个或者更多胚胎的信号。核移植胚胎着床效率低，需要移植大量的胚胎。若无足够的胚胎用来移植则可采用以下两种方法，一种方法是植入“辅助胚胎”来帮助诱导和维持怀孕，可以选择能够怀孕但在怀孕的第30天因染色体印记而退化的孤雌生殖的胚胎，也可以选自正常的交配得到的受精胚胎；另一种方法是在移植第12天时使用药物处理，以维持妊娠^[2]。

当前的克隆猪生产效率仍然较低（1%-2%）^[35]。SCNT的过程是一个表观遗传学重编程的过程，目前普遍认为克隆动物技术效率低的主要原因是由于表观遗传学重编程不完全或发生异常。核移植研究中发现，用一些影响细胞核重编程过程中DNA和组蛋白甲基化或乙酰化的药物处理核移植重构胚胎可以提高克隆胚胎的发育率，如使用去乙酰化酶抑制剂TSA、Scriptaid等来处理克隆胚胎，可显著提高猪体细胞克隆胚胎体外发育囊胚率^{[36, 37]}。

3 猪的SCNT的意义及应用

猪被认为是重要的哺乳动物模型，其在解剖、生理、器官大小、器官发育、营养代谢、基因表达、疾病发展过程等多方面与人类十分相似；同时其具有基因多样性，繁殖周期短，一窝产子多，5个月就能达到性成熟，寿命较长等优势特征，便于根据特殊需要进行选育。与经典的模式动物小鼠相比，由于啮齿类发育过程、解剖生理指标与人类区别较大，对于人类疾病的参考价值较小，此外在生物反应器的制备要求以及异种器官移植等方面小鼠也不能达到要求。而以猴子为代表的非人类灵长类动物存在资源和伦理上的限制及技术上的不成熟。因此对猪的基因组实现定点修饰在农业和生物医药领域有重要的意义。除了SCNT方法外，成功获得转基因猪的技术还有原核显微注射法、逆转录病毒载体法、精子载体法等。1985年，由Hammer等^[38]利用原核显微注射法获得基因修饰猪。但该技术存在目的基因整合位点随机性，且易产生嵌合体，同时若没有发生生殖系嵌合则不能获得基因修饰动物的后代。因此该方法并不是适用于大型动物。此外，病毒载体法和精子载体法在转基因猪制作上的效果都不理想，如病毒载体法目的基因大小受到限制、易产生嵌合体且存在安全上隐患，精子载体法存在随机整合、实验重复性差等问题。目前SCNT方法是构建基因修饰猪的主流方法。

从2002年首例基因敲除猪报道以来，利用传统同源重组和SCNT方法仅获得了几种基因打靶猪^{[10, 39, 40]}。传统基因打靶技术利用的是细胞内自然发生的HR，其本身效率就很低，通常只有10-6^[41]，因而体外基因定点整合的效率是极低的，并且基因打靶通常需要加入正负筛选标记，经过长时间的体外培养和大量药物筛选，细胞易衰老，染色体易损伤，实际操作的工作量增加，这些因素限制了获得基因修饰猪的效率。所以大动物基因敲除模型获得成功的报道并不多，低效率因素严重制约了大动物基因修饰模型研究的发展。近年来新兴了多种基因高效靶向修饰和调控技术，包括锌指核酸酶技术（zinc finger nucleases，ZFNs）、转录激活子样效应因子核酸酶技术（transcription activator-like effector nuclease，TALENs）及CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas9（CRISPR-associated 9）技术等。这些新兴技术极大地提高了基因敲除的效率和特异性，为猪的高效基因打靶研究奠定了技术基础。目前ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9在猪物种上均实现基因定点修饰，已获得了多种修饰猪^[41-43]。这些新技术为基因修饰猪构建研究开辟了新的途径，基因修饰猪将在生物学、医学领域研究中展开更多深入的研究。

猪的SCNT技术的建立在农业和医学有广泛的应用。一方面利用SCNT可以加速猪种遗传改良进程，促进优良品种传播；同时利用SCNT可以保存优良猪种资源，冷冻体细胞实验操作上比冷冻精液或胚胎更为容易。另一方面猪的SCNT与基因修饰技术相结合，生产基因修饰猪，在农业生产上可提高猪肉生产效率，生产更为健康的产品，提高猪抗疾病能力^[44]等；在医药领域制作转基因猪生物反应器，通过乳腺、血液等生产医用蛋白、药物、重组抗体等^[45]；同时在猪上进行人类相关疾病致病基因的修饰，能高保真地复制一些人类疾病，用于研究疾病机理、药物研发治疗方法等；猪也被认为是一种比较理想的异种器官移植供体来源动物^[46-48]，尤其是小型猪在器官大小和外科手术操作上的优势使之更适合于异种器官移植研究。用经过一定遗传修饰而得到的克隆动物提供心脏、肝、肾等器官，可大大降低异种器官移植时存在的超急性排斥反应。这也是猪核移植技术的重要意义之一。

尽管利用SCNT已成功获得了许多种克隆动物，但是对于这一技术本身的基础研究还不够完善，对其机理研究还不是很深入，克隆过程中还存在亟待解决的问题，如猪的SCNT效率还很低，克隆动物易出现出生体重异常，器官缺陷，先天疾病等问题。SCNT的过程是一个表观遗传学重编的过程，目前普遍认为克隆动物技术效率低的主要原因是由于表观遗传学重编程不完全或发生异常。随着基础研究的深入及相关技术完善，能进一步提高猪SCNT的效率，促进基因修饰猪研究的发展。