木霉（Trichoderma）属半知菌亚门（Deuterom-ycotina）、丝孢纲（Hyphomcetes）、丝孢目（Hypho-mycetales）、丝孢科（Hyphomycetaceae），种类繁多，资源丰富，环境适应性强^[1]，农业上多用于防治土传植物病害，如黄瓜枯萎病、玉米小斑病和辣椒根腐病^[2-4]等。此外，木霉可通过产生植物生长调节剂、抑制根际有害物质、增加养分利用率等多种机制促进植物生长^[5]，并能够增加植株幼苗叶绿素、可溶性蛋白质含量和生理生化酶的活性^[6]。近年来，有学者将木霉的功能扩展到环保领域，利用其对超积累植物的促生作用联合修复重金属污染土壤^[7]。到目前为止，在污染修复实际运用中通常是将木霉的发酵液或固体发酵混合物一起施入土壤，所用菌剂货架期短，不便于包装、贮藏、运输和施用。

可湿性粉剂（Wettable Powders）是含有原药、载体（填料）、表面活性剂（润湿分散剂等）、辅助剂（稳定剂、警色剂等）并粉碎得很细的制剂。此种制剂在用水稀释成田间使用浓度时，能形成稳定的悬浮液。它的优点在于成本低，活性稳定，便于生产及商品化，一直处于稳定发展状态。本课题组在前期研究阶段从土壤中筛选得到里氏木霉FS10-C，该菌株具有重金属Cu、Cd抗性，接种木霉FS10-C能提高铜超积累植物海州香薷和镉超积累植物伴矿景天的生物量，是一株颇具应用潜力的土壤修复真菌^{[8, 9]}。经过对其扩大培养条件进行摸索并优化后^[10]，本研究以里氏木霉FS10-C固体发酵所获得的分生孢子粉为原药，研究不同载体和润湿剂、分散剂、保护剂等助剂与木霉菌的生物相容性，通过正交设计筛选FS10-C菌株可湿性粉剂的优良配方，并测定该制剂对伴矿景天生长的影响，为里氏木霉的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株

里氏木霉（Trichoderma reesei）FS10-C（保藏编号：CGMCC No.3970）分生孢子粉，含孢量为1.8×10¹⁰个/g，由中国科学院土壤环境与污染修复重点实验室提供。

1.1.2 供试药品

载体：硅藻土、轻质碳酸钙、硅胶粉、高岭土；湿润剂：拉开粉BX、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠；分散剂：聚乙二醇、木质素磺酸钠、六偏磷酸钠、羧甲基纤维素钠；保护剂：荧光素钠、黄原胶、维生素C、卵磷脂。以上药品均购于南京博巧生物科技有限公司。

1.1.3 供试植物

伴矿景天苗，采自浙江沿海东部某重金属污染修复基地，采回后将植株通过Hoagland’s 营养液在温室中水培使其生根，选择大小一致，长势良好的植株苗，备用。

1.2 方法 1.2.1 生物相容性检测

孢子萌发率测定：参照王芳等^[11]的方法，将木霉孢子粉配制成107个孢子/mL的悬液，吸取 1 mL 加入到盛有 9 mL 萌发液（蔗糖2 g，蛋白胨0.5 g，磷酸二氢钾0.5 g，水100 mL，灭菌）的三角瓶中，以1 000 μg/mL的浓度分别向其中加入载体和湿润分散剂，于恒温摇床上振荡培养24 h后（25±1℃，120 r/min），在显微镜下用血球计数板测液样中发芽的孢子数，重复3次，计算平均萌发率即活孢率（孢子萌发的标准为可见芽管长度等于或者大于孢子直径）：

菌落日增长量测定：将载体和润湿分散剂分别以1 000 μg/mL的浓度与融化的PDA培养基混合，灭菌后制成平板。用直径为4.5 mm的打孔器，取生长旺盛的菌丝块，接种到上述方法制作的混合平板上，采用十字交叉法，分别在菌株生长24 h、48 h和72 h后测一次各菌落的直径，设3个重复，对照为普通的PDA平板。计算菌落生长速率：

其中，d为菌落生长天数。

1.2.2 载体的筛选

以生物相容性检测指标为依据，再根据载体流动性、价格等方面因素确定最佳载体。

1.2.3 助剂的筛选

湿润剂的筛选：以1 g为基数，孢子粉质量占30%，湿润剂质量占10%，载体占60%，采用尝试法，将润湿剂、载体和孢子粉加工成可湿性粉剂测定润湿时间，筛选出润湿时间相对较短的润湿剂，再结合生物相容性结果最终确定。

分散剂的筛选：以1 g为基数，孢子粉质量占30%，湿润剂质量占10%，分散剂质量占10%，载体占50%，按照GB/T 14825-2006^[12]测定其悬浮率，结合生物相容性结果，确定最佳分散剂。

保护剂的筛选：配制木霉菌分生孢子浓度为103个/mL，保护剂浓度为0.3%的混合悬浮液。用移液枪吸取0.1 mL悬液于无菌盖玻片上，将各盖玻片置于紫外灯下20 cm处照射 10 min后，将玻片平放在培养皿底部，皿中用湿润的滤纸保湿。培养皿在（25±1）℃下黑暗培养24 h 后，在显微镜下抽样计数萌发孢子数并计算出萌发率。以不加紫外保护剂的孢子悬液作照射和不照射的对照处理。按下式计算保护效能指数：

1.2.4 助剂成分比例优化

以1 g为基数，其余用载体补足100%，分别以孢子粉、湿润剂、分散剂、保护剂为实验因素，选择不同因素助剂按常用质量分数用量设计3个水平，以悬浮率为测试指标，进行正交设计。

1.2.5 木霉菌可湿性粉剂的促生效果测定

盆栽实验共设计3个处理，分别为：①施加可湿性粉剂（WP）。具体步骤为将可湿性粉剂兑水稀释500倍后，每盆灌根100 mL，在伴矿景天生长的第30、60、90 和 120天时，分别追加一次，用量均为100 mL/盆；②施加单一载体助剂混合物（WCK，孢子粉所占比例用载体补足），其施用方式与WP一致；③对照（CK）。每处理3次重复。将土壤过10目筛后分别和氮磷钾基础肥料（以N 0.15 g/kg，P₂O₅ 0.10 g/kg，K₂O 0.15 g/kg干土计，其中N、P、K分别以（NH₄）₂SO₄、NaH₂PO₄和KCl的形式加入）拌匀，每盆（花盆规格：外口径23.5 cm，内口径20.1 cm，高14 cm）装土1.5 kg（烘干基）。取已发根的株高约10 cm的伴矿景天苗移栽至花盆中，每盆定苗5株。植物生长过程中用去离子水浇灌，并用称重法保持土壤含水率为最大田间持水量的70%。试验在植物生长室中进行，每日光照14 h，日温25℃，夜温20℃，湿度60%-70%。植物样品后4个月后收获。用不锈钢剪刀沿土面剪取地上部，测定植株鲜重。分别用自来水、去离子水洗涤，105℃杀青30 min，80℃烘干，测定植株干重。

1.2.6 数据统计分析

采用 Excel2003和SPSS19.0软件对数据进行相关分析，用最小显著性差异法（LSD）进行显著差异检验（P<0.05）。

2 结果 2.1 载体的筛选

4种载体对里氏木霉FS10-C活力的影响（表 1）显示，除高岭土对分生孢子萌发与对照差异不显著外，其余3种载体均能显著抑制孢子萌发（P<0.05），其中加入轻质碳酸钙的处理其孢子萌发率只有4.5%。对菌落日增长量影响显示，硅胶（4.60 cm/d）与对照（4.60 cm/d）差异不显著（P>0.05）；硅藻土（4.20 cm/d）、高岭土（4.08 cm/d）对菌丝生长有轻微抑制作用；轻质碳酸钙菌落日增长量只有3.65 cm/d，对菌丝生长具有严重抑制作用。综合上述结果，再结合来源和价格等因素，选择高岭土作为FS10-C菌株的载体。

2.2 湿润剂的筛选

我国国标对可湿性粉剂的润湿时间要求为180 s 以内，当木霉孢子粉比例为30%时，湿润时间达到了237.2 s（表 2）。添加湿润剂后，润湿时间明显缩短且均小于 180 s。其中拉开粉BX、十二烷基硫酸钠及十二烷基苯磺酸钠的润湿效果明显，润湿时间小于150 s，生物相容性测定显示加入十二烷基苯磺酸钠的孢子萌发率最高，达69%；拉开粉和十二烷基硫酸钠萌发率均低于60%。湿润剂对菌落日增量的抑制作用也非常明显，其中最高的十二烷基苯磺酸钠值仅为2.85 cm/d。综合润湿剂的润湿时间和相容性实验的结果，可选择十二烷基苯磺酸钠作为FS10-C菌株的润湿剂。

2.3 分散剂的筛选

由表 3可知，静置30 min后，对照悬浮率仅为29.58%，添加分散剂后处理组悬浮率明显高于对照，值介于57.04%-60.23%之间，接近或达到国标要求。但处理之间差异不显著。生物相容性实验结果显示，当培养基中加入500 μg/mL的分散剂后，各处理孢子萌发率和菌落日增长量均低于对照，说明分散剂对木霉菌的生长有一定的抑制作用。其中添加木质素磺酸钠处理组孢子萌发率最高为83.0%，其次为聚乙二醇，萌发率为76.9%，而羧甲基纤维素钠的萌发率仅为72.1%。菌落日增长量方面，以羧甲基纤维素钠和木质素磺酸钠处理组值最高，分别为3.75和3.70 cm/d。综合各分散剂悬浮率和生物相容性实验结果，选择木质素磺酸钠为最佳分散剂。

2.4 保护剂的筛选

由于木霉菌施用到土壤中，阳光中的紫外线直接对活菌体构成了威胁。因此有必要在可湿性粉剂中加入UV保护剂。UV保护剂能将阳光中的大部分紫外辐射吸收掉，将吸收的能量转化为无害的热能散发到空气中，从而保护制剂达到所需要的效果。不同保护剂对木霉孢子的保护程度是不同的，具体结果如图 1所示。经紫外灯照射后，木霉孢子的萌发率受到明显影响，以维生素C的保护效能指数最高，达到了0.692 3。相比较而言，其余3种保护剂对孢子保护作用极差，因此，可以将维生素C作为里氏木霉FS10-C可湿性粉剂的保护剂。

2.5 可湿性粉剂各成分比例的确定

完成上述单因素的筛选后，以悬浮率为指标，通过正交实验设计助剂配比。以1 g为基数，其余以高岭土补足。结果（表 4）显示，最佳组合为孢子粉10%、十二烷基苯磺酸钠5%、木质素磺酸钠10%、维生素C 0.4%、高岭土74.6%时，悬浮率最高，达到了72.48%。

2.6 木霉可湿性粉剂对伴矿景天生长的影响

表 5显示，在盆栽周期内，不同处理对伴矿景天地上部的生长有显著的影响。其中，施加木霉制剂WP处理组鲜重、干重分别高于对照14.70%及23.14%，均达到显著水平（P<0.05）。而WCK处理组鲜重和干重只比对照组增加6.23%和15.60%，且差异不显著。说明单一载体和助剂的混合物并不能提高植物生物量，有里氏木霉 FS10-C 分生孢子的可湿性粉剂成率高，能较好地发挥木霉菌的促生作用。

3 讨论

木霉作为微生物菌剂中常见菌种^[13]，其自身可以产生植物激素，如细胞分裂素、吲哚乙酸等从而调节植物的生长发育和其他生命活动，实际推广应用价值较大，因此其制剂加工研究尤为重要。根据木霉菌分生孢子的性质，一般可以将其加工成活分生孢子制剂，剂型为粉剂和可湿性粉剂。由于可湿性粉剂比粉剂能更好储藏，适应环境能力更强，在含量和效果上也都优于粉剂，所以目前选择可湿性粉剂作为剂型开发对象的研究较多^[14-17]。木霉制成可湿性粉剂后，一般用于种子处理、叶面喷洒、通过滴灌、喷灌、浇灌等方式来促进植物生长。在可湿性粉剂中载体一般占有较大比例，是必不可少的原料。载体多是具有网孔结构或片层状结构、比表面积大、有较强的吸附能力和吸附容量的物质。使用载体的目的主要是将孢子粉、助剂均匀吸附、分布在载体的粒子表面，使其形成均匀的混合物。木霉菌可湿性粉剂载体的筛选原则：对木霉菌孢子的活性没有影响或者影响很小，具有适当的惰性和分散性，成本低，易加工^[18]。本研究通过悬滴法和立体平板培养法，测定载体对菌株生物相容性的影响。结果显示，4种供试载体中高岭土对里氏木霉FS10-C菌株的孢子萌发率和菌丝生长速率影响最小，因此，将其确定为可湿性粉剂的载体。

由于木霉分生孢子是不溶于水的颗粒状生物体，为降低表面张力需要加入湿润剂和分散剂。从实验结果可以看出当润湿剂和分散剂浓度超过0.5 g/L，对孢子萌发和菌丝的生长都有抑制作用。润湿剂中以十二烷基苯磺酸钠对木霉孢子的生物相容性最好，湿润时间小于150 s，因此可以用于后续研究；木质素磺酸钠对木霉孢子活的影响低于其余处理，其悬浮率也达到了60.23%，所以可选用木质素磺酸钠作为分散剂。为防止紫外线对孢子的杀伤作用和增加孢子在环境中稳定性，在制剂中加入对孢子无害的保护剂是必要的。在本研究的4种保护剂中，以维生素C的保护效能指数最高，因而可以直接选择维生素C作为保护剂。利用正交实验摸索各种助剂的最佳配方，使悬浮率尽可能高。在实验过程中发现3号组合，即孢子粉、高岭土、十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠、维生素C所占比例分别为 10%、74.6%、5%、10%和0.4%时湿润效果很好，悬浮率最高，达到了72.48%，符合可湿性粉剂质量标准。

伴矿景天作为一种锌镉超积累植物，被广泛认可为用于锌镉污染土壤修复的良好资源^{[19, 20]}。但与大部分超积累植物一样，伴矿景天也存在着植株矮小，生物量低等问题，修复效率受到很大影响。因此选择环境友好的微生物菌剂来促进其生长不失为一个好的方法。将本研究制得的木霉可湿性粉剂运用到盆栽实验中进行检测，结果表明，里氏木霉 FS10-C菌株制剂对伴矿景天具有良好的促生作用，能不同程度地提高植株地上部生物量。但有关该制剂在大田试验中的效果验证、成分改进和促生机制等有待进一步深入、系统研究。

4 结论

本研究通过对载体和助剂种类及含量的筛选，研制出里氏木霉FS10-C可湿性粉剂，其较优配方可确定为：孢子粉10%、高岭土74.6%、十二烷基苯磺酸钠5%、木质素磺酸钠10%、维生素C 0.4%。该制剂悬浮率可达72.48%，符合可湿性粉剂的要求。经初步测定，木霉菌剂对伴矿景天的促生效果明显，在土壤重金属污染的植物-微生物联合修复方面有一定的应用前景。