石油是一种重要的战略性资源，近年来，随着海洋石油开采业的发展和远洋运输业的繁荣，海上溢油事故时有发生，严重污染了海洋环境，给海洋生态平衡带来了严重的威胁[1]。2010年，美国墨西哥湾钻井平台“深水地平线”发生爆炸，使墨西哥湾沿岸生态环境遭遇了“灭顶之灾”；同年，我国大连新港“7.16”爆炸事故导致上万吨原油泄漏进入渤海湾，这是我国历史上发生的最为严重的海上溢油事故[2, 3]。据统计联合国环境规划署报告，每年流入海洋的石油约为2×106-2×107 t，海洋石油污染已成为一个世界性的环境问题[4]。
治理海洋石油污染主要有物理方法、化学方法及生物方法，其中，生物修复法是利用微生物对污染物的降解作用达到去除油污的目的，具有成本低廉、无二次污染、可原位修复等显著优点[5, 6]，筛选优良的微生物资源用于石油污染的修复，已受到人们的广泛关注。Hassanshahiand等[7]分离到一株柴油食烷菌（Alcanivorax dieselolei）PG-12；郭平等[8]从表层海水分离到一株厦门栖东海菌（Donghicola xiamenensis）HD-1；姜肸等[9]从南海筛选到6株石油降解菌，分属于芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞菌（Pseudomonas）、交替单胞菌（Alteromonas）等菌属，均表现出良好的石油降解效果。但由于石油是由各类烷烃、芳烃及其他成分构成的复杂混合物，不同的菌株对不同碳链的烷烃、芳烃的降解情况差别较大[10]，利用菌株间的共生、协同等作用构建复合菌，则可扩大对石油类底物的利用范围和效率，进而实现对污染物的高效降解[11, 12]。张海玲等[13]采用4株细菌构建了石油降解菌系；Van Hamme 等[14]将假单胞菌与红球菌混合培养构建复合菌系；Li等[15]富集得到了菌群KO5-2，相比于单一菌株，均显著提高了原油的生物降解率。目前，采用复合菌系修复海洋石油污染的过程中，尚缺乏对环境因素作用的系统分析；单一菌株与复合菌系降解特性比较方面的研究也相对较少。
近岸海域与人类的关系较为密切，该区域内的石油降解菌较远洋中可能存在较大的差别，目前尚未有专门针对该区域的石油降解复合菌系的研究。本研究即是以原油为唯一碳源，从深圳近岸海域筛选高效石油降解菌，采用复配、正交试验等方法构建石油降解复合菌系，并对其降解特性展开充分的研究，旨在为工业化菌剂的开发及应用提供参考及借鉴。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 海水及石油样品海水样品取自深圳市蛇口港和盐田港，在113.9°E-114.2°E，22.4°N-22.5°N范围内5个不同位点取样；实验用油为惠州大亚湾石化工业区提供的原油，25℃下密度约为0.9 g/mL。
1.1.2 培养基及试剂MMC培养基[16]（g/L）：NaCl 24，MgSO4·7H2O 7，NH4NO3 1，KCl 0.7，KH2PO4 2，Na2HPO4 3，pH7.4，1.0×105 Pa灭菌30 min。补加微量元素混合液（g/L）：CaCl2 0.02，FeCl3·6H2O 0.5，CuSO4 0.005，MnCl2·4H2O 0.005，ZnSO4·7H2O 0.1。固体培养基另加琼脂15-20 g。平板表面均匀涂抹一层原油，制备成油平板。
2216E培养基（g/L）（用于菌种的培养）：蛋白胨5，酵母膏1，柠檬酸铁0.10，NaCl 19.45，MgCl2 5.98，CaCl2 3.24，KCl 0.55，Na2CO3 0.16，KBr 0.080，SrCl2·6H2O 0.034，H3BO3 0.022，Na2SiO3·9H2O 0.004，NaF 0.002 4，NaNO3 0.001 6，Na2HPO4 0.008，pH 7.4-7.8，固体培养基另加琼脂15-20 g。
石油培养基（用于降解菌的富集、降解率的测定试验）：每100 mL MMC培养基中加入1 g原油作为唯一碳源。
兔血平板培养基（用于表面活性剂的定性检测）：固体2216E培养基融化后冷却至50℃，加入2-3滴无菌兔血摇匀后倒平板。
本研究所用的酶、dNTP等分子生物学试剂购自北京全式金生物技术有限公司；GC-MS实验所用流动相、标准品等购自国药集团；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 石油降解菌的筛选及产表面活性剂测定取5 mL海水样品加入100 mL石油培养基中，30℃、180 r/min培养7 d，取5 mL培养液转接至新鲜的石油培养基，重复以上步骤，连续转接富集培养4次，培养基中原油量依次提升至1.0、1.5和2.0 g。将乳化现象明显的样品梯度稀释，取0.1 mL涂布于石油平板，30℃培养3-5 d，挑取周围有透明圈的菌落于2216E平板纯化、待测。
将各菌株用无菌牙签依次挑至兔血平板培养基上，30℃培养2-3 d，根据菌落周围透明圈的大小判断表面活性剂的浓度[17]。将活化后的菌株以5%的比例接种到石油培养基中，以不接菌的培养基作为空白对照，30℃、180 r/min培养5 d。采用铂金环式表面张力测定仪测定培养液的表面张力。
1.2.2 石油降解率的测定石油浓度的测定采用紫外法，参考蒋瑞萍[18]的方法制作吸光度-石油浓度的标准曲线，略有改动。在一系列50 mL的容量瓶中加入不同量的原油母液（1 g/L），用二氯甲烷定容，260 nm处测定吸光度。为保证结果准确，加标回收率控制在95%-105%之间。
各菌株接至2216E培养基中培养至对数期，离心收集菌体，用无菌MMC洗涤2次，平板涂布法测定细胞数目并稀释浓度≈108 CFU/mL，以5%的比例（V/V）接种至石油培养基中，30℃、180 r/min振荡培养7 d，以未接菌的培养基作为对照。向各样品中加入50 mL二氯甲烷，200 r/min振荡20 min，再于40℃下超声15 min萃取其中的残余油污，离心去除菌体碎片。从二氯甲烷相吸取0.2 mL 溶液定容于50 mL容量瓶，260 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算样品中残余的石油浓度：
其中，C1为对照中石油浓度，C2为样品中石油浓度。每个样品3次重复，下同。
1.2.3 石油降解复合菌系的构建根据降解率和产表面活性剂情况，优选5株细菌分别接种至2216E中培养至对数末期，种子液离心、洗涤后用平板涂布法调节为一致的浓度（108 CFU/mL）。各菌以等比例随机配伍的方式接至石油培养基中，总接种量为5%（体积比），30℃、180 r/min培养7 d后测定石油降解率。选择降解率最高的1个组合，通过3水平（0.5%、1.0%和2.0%）的正交实验确定各菌株的接种量。
1.2.4 菌株的鉴定生理生化实验及16S rRNA基因序列分析参照吴秉奇等[19]方法，PCR产物由上海生工生物工程有限公司测序，结果提交GenBank获取登录号，采用MEGA软件构建系统发育树。
1.2.5 石油降解条件的优化在石油培养基中接种复合菌系，摇床培养7 d，设置不同的培养条件。（1）培养温度：22、26、30、34和38℃；（2）培养基初始pH值：6.4、7.0、7.6、8.2和8.8；（3）摇床转速：160、180、200、220和240 r/min；（4）初始油浓度：1.0、5.0、10.0、20.0和40.0 g/L。石油降解率的测定方法同1.2.2。
将以上因素设置为最佳条件，定时取样测定复合菌系对石油的降解情况，同时采用平板计数法对培养液中细菌进行菌落计数。
1.2.6 复合菌系对石油的降解特性采用GC-MS法测定石油生物降解后各烷烃组分的残留情况。将复合菌系以最佳接种量接种至石油培养基，30℃、180 r/min条件下培养7 d。培养液前处理同1.2.2，取待测液用干燥无水Na2SO4脱水，再经0.22 μm有机系滤膜过滤，氮气吹干后用二氯甲烷重新溶解。GC-MS运行条件：全扫描模式；色谱柱为RYX-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱温45℃，以 5℃/min的速度升至300℃，停留20 min；进样口、离子源、四级杆温度分别为250、230和150℃；载气为氦气；进样量1 μL。数据分析用安捷伦5975-7890A工作站。
1.2.7 数据统计及分析使用SPSS 18.0和ORIGIN 8.6软件对数据进行整理；采用新复极差法，在0.05水平上分析差异显著性（P<0.05）。菌株16S rRNA基因序列通过DNAMAN 7.02拼接后进行BLAST分析，利用MEGA 6程序的Neighbor-joining算法构建系统发育树。
2 结果 2.1 石油降解菌的筛选及产表面活性剂情况对5个取样点的样品进行驯化，选择乳化现象较为明显的样品分离细菌，共获得68株石油降解菌，分别测定各菌株对石油的降解率及培养液的表面张力。如图 1所示，共有22株细菌对石油的去除情况较好，接种7 d后，菌株S1-3A、S1-12、S1-38等3株细菌对石油的降解率超过50%，其中S1-38可达52.2%。同时发现，菌株S1-5、S1-12、S1-22、S1-30、S1-37、S1-41B和S2-13等7株细菌在兔血平板上可产生较为明显的透明圈，其培养液的表面张力相比于对照也有大幅下降，最高达44.6%，初步推断以上菌株能够产生表面活性剂，促进石油的乳化、分散；其余接菌处理培养液的表面张力也有不同程度的降低。
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| 图 1 菌株对石油的降解率及培养液表面张力测定 |
根据降解石油及产表面活性剂情况，排除菌株间的拮抗作用，选择S1-3A、S1-12、S1-30、S1-38、S2-13等5株细菌，通过等比例接种的方式分别构建二阶至五阶复合菌系，共计25种组合，测定各组合对石油的降解率，结果见表 1。
结果（表 1）显示，复合菌对石油的降解率在53.4%-63.7%之间，均高于单一菌株；凡同时接种S1-38和S2-13的组合均具有较高石油降解率，由S1-38、S1-30、S2-13等3株细菌构成的复合菌系对石油的去除情况最好，7 d内对石油降解率可达63.7%。设计3因素3水平的正交实验对该组合中各菌株的接种量加以优化，结果见表 2。
表 2中R值显示，接种量对S1-38的影响最大，其次为 S1-30，对S2-13的影响较小；当S1-30取2.0%水平，S1-38取1.0%水平，S2-13取1.0%水平时，各自具有最高的K值，理论上采用该接种量时，复合菌应该具有最高的石油降解率。按此接种量制备复合菌系，培养7 d测得其对石油的降解率为68.3%，高于正交实验中的任一组合，与预期相符，将该菌系命名为SQ1。
2.3 石油降解菌的鉴定3株细菌在2216E 平板上培养48-72 h后，S1-30呈不透明的淡黄色圆形菌落，直径0.5-1.5 mm，表面光滑、凸起、湿润；镜检为（1 000×）G+，菌体呈短杆状，（0.3-0.6）×（1.0-4.0）μm，单生或簇生。S1-38呈淡红色圆形菌落，直径0.2-1.0 mm，表面光滑、凸起，有黏液，边缘整齐；镜检为G+，菌体呈球状，（0.5-1.0）×（0.5-1.0）μm。S2-13呈灰白色不规则圆形菌落，直径2.0-3.0 mm，凸起；镜检为G-，菌体呈杆状，（0.5-1.0）×（1.0-5.0）μm，单生。生理生化实验结果见表 3。
采用通用引物扩增3株细菌的16S rRNA基因序列，得到大小约为1 400-1 500 bp的片段，测序后将序列与GenBank中近缘模式种进行BLAST分析，选择相似度较高的菌株序列采用邻接法构建系统发育树，以Methanococcus vannielii作为外群，结果见图 2。
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| 图 2 基于16S rRNA基因的菌株系统发育树 |
由图 2可见，菌株S1-30与棒杆菌属（Coryneba-cterium）下的几种细菌模式种聚为一个类群，与菌株Corynebacterium variabile DSM 44702T、Corynebacteri-um sp. CMH010.H4.1和Corynebacterium variabilis DSM 20132T的相似度均为99%；S1-38与迪茨氏菌属（Dietzia）下几种细菌模式种聚为同一类群，与Dietzia timorensis ID05-A0528T、Dietzia sp. Ac4等菌株的相似度均为99%；S2-13与拉布伦茨氏菌属（Lab-renzia）细菌聚为同一类群，与菌株Labrenzia sp. MBTDCMFRIMab26的相似度达100%。结合生理生化实验结果，将菌株S1-30鉴定为棒杆菌，将S1-38鉴定为迪茨氏菌，将S2-13鉴定为拉布伦茨氏菌；GenBank登录号分别为KP114217、KP114218、KP114219。
2.4 SQ1降解石油条件的优化通过单因素实验，测定培养温度、摇床转速（通气量）、初始pH值、初始石油浓度等4种因素对复合菌系SQ1降解石油的影响，结果见图 3。
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| 图 3 环境因素对SQ1降解石油的影响 |
如图 3-A所示，30℃是SQ1降解石油的最适温度，降解率为67.2%；过低或过高的温度对SQ1降解石油均具有负面影响，22℃和38℃时的去除率仅为45.4%和50.5%。石油浓度（图 3-B）对SQ1降解石油的影响同样显著，当石油浓度为1 g/L时，其生物降解率仅为31.4%；随着浓度的提升，SQ1对石油的去除率也逐渐升高，当浓度为20 g/L时，其降解率可达67.3%；但当石油的浓度进一步升至40 g/L时，SQ1对石油的降解率出现明显的下降。图 3-C所示，初始pH方面，SQ1在pH为7.0-8.8范围内对石油均有较高的降解率（>60%），当pH为7.6时，SQ1对石油的降解率最高，可达67.6%。通气量（图 3-D）对石油去除率的影响较小，当摇床转速达到180 r/min以上时，SQ1对石油的降解情况无显著差别。
2.5 培养过程中石油降解及菌系SQ1的变化根据2.4的结果，将温度、pH、转速和石油浓度分别调节至 30℃、7.6、200 r/min和20 g/L，定时取样测定SQ1对石油的降解和反应体系中各细菌的生长情况。
结果（图 4）显示，复合菌系SQ1对石油表现出持续的降解能力。接种后1-7 d内，石油的降解情况呈指数增长，此后石油的生物降解速率有所下降，培养11 d时，石油的去除率达到最高（73.5%）。在石油的降解的过程中，复合菌系SQ1中3种细菌的生长状况差异较大，S1-38在培养1-5 d内大量生长，7 d后活菌数呈不断下降的趋势；S2-13在培养3-9 d内活菌激增，此后有小幅下降；S1-30的生长速度较其他2株菌慢，但其活菌数始终处于增长状态，表现出持续的石油降解能力。
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| 图 4 培养时间对石油降解及细菌生长的影响 |
采用GC-MS法对石油生物降解后的残留组分定量分析，结果见图 5。
图 5显示，菌株S1-30、S1-38、S2-13和复合菌系SQ1对石油总烷烃的去除率分别为87.55%、73.11%、87.55%和91.69%，均能够降解C10-C35之间的大部分正构烷烃，其中对C10-C13、C21-C24、C27、C30、C32、C33等烷烃的降解率为100%。相比于单一细菌，复合菌系SQ1降解烷烃的能力更强，对C10-C16和C21-C35之间（除C25）烷烃的降解率也达到了100%，对本研究中较难以降解的C16-C20之间烷烃的去除效果也要好于单一细菌。
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| 图 5 降解后石油中烷烃含量 |
已有报道表明，海洋环境中存着数百种微生物能够参与石油烃类的降解，其中大部分为细菌，如：不动杆菌（Acinetobacter）、假单胞菌、红球菌（Rhodococcus）、嗜盐单胞菌（Halomonas）、食烷菌（Alcanivorax）、海杆菌（Marinobacter）和 微杆菌（Microbacterium）等[7, 20, 21]。本研究从深圳近海分离到的22株石油降解菌，对石油的降解率最高为52.4%，与其他已报道的菌株相比，其降解能力处于中间水平[8, 9, 22]，但本研究分离到菌株广泛分布于副球菌（Paracoccus）、拉布伦茨氏菌、鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis）、假单胞菌以及迪茨氏菌等菌属，其中，拉布伦茨菌在海洋石油降解方面的作用为首次报道。
研究表明，分泌表面活性剂是一些菌株能够高效利用石油烃的重要因素，例如：菌株Pseudomonas sp. BP10即是通过产表面活性剂降低了培养液表面的张力，提高了对石油的摄取作用[23]；Bacillus methylotrophicus USTBa不仅能够分泌表面活性剂，其产物对某些细菌还具有一定的拮抗作用[24]。依据在血平板上产生透明圈的大小和培养液的表面张力降低幅度，本研究将S1-12等7株细菌初步判定为表面活性剂高产菌，但7株细菌中S1-12、S1-30和 S2-13等3株菌的石油降解能力明显强于另外4株，这说明除了产表面活性剂外，菌株的生长状态、分泌的降解酶系等因素与石油降解能力也密切相关。有报道表明，细菌产表面活性剂的多少与降解石油的能力呈正相关[25, 26]，但本研究的结果却有所不同，如：S1-3A和S1-38虽然表面活性剂的产生特征不明显，但对石油的降解能力却较强，这可能与其细胞表面特性有关，也可能是分泌的其他代谢产物的缘故。由于培养条件、底物浓度等外界因素与细菌产表面活性剂息息相关[24]，本研究菌株所产表面活性剂的类型及产量还需通过红外法、薄层层析法等手段做进一步分析。
依据对石油的降解能力和产表面活性剂的情况，本研究选择5株石油降解菌进行复配，并通过正交实验优化接种量，构建了由棒杆菌S1-30、迪茨氏菌S1-38和拉布伦茨氏菌S2-13组成的复合菌系SQ1。结果显示，SQ1对石油的降解率可达68.3%，相比于单一细菌至少高出16.1%，GC-MS结果也表明SQ1对石油的去除效果要好于单一菌株。与其他报道的复合菌系相比，SQ1的降解能力略低于Bao等[27]采用苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）和类短短芽孢杆菌（Brevibacillus parabrevis）构建的四元复合菌系（79%）；在2%的原油浓度下，与Sathishkumar[28]构建的四元菌系降解能力相近（72%-76%）；高于张海玲等[12]构建的复合菌系（61.3%）。但SQ1对石油总烷烃的去除率可达91.7%，对石油组分降解情况较为特殊。一般来说，石油中的短链和中链组分更易于生物降解[29, 30]，但SQ1对石油中C21-C35等长链烷烃的降解率几乎为100%，对C10-C16等中链烷烃的降解却不是很彻底，这可能是由于SQ1中的3株细菌含有长链烷烃降解需要的特殊酶系基因[31]。此外，3株细菌表现出明显的协同作用，一方面是由于菌株S1-30和S2-13通过产生表面活性剂，提高了S2-13对各种碳源的利用，也可能是3株细菌在底物利用和代谢途径上具有互补性[32]。
本研究发现，反应体系的温度、石油浓度及pH对SQ1降解石油的影响较为显著。温度不仅可以影响微生物本身的代谢活性，对石油的物理状态、化学组成也具有一定的影响，直接关系到石油的生物降解率；而作为唯一碳源，石油浓度过低则养分不足，过高又会对微生物产生毒害；pH是通过对微生物的代谢及酶活性的调节产生影响[28, 33]。总体来看，SQ1适于在中等温度、较高的石油浓度以及偏弱碱性的环境下发挥降解作用，这与我国南方的海洋环境较为接近。此外，微生物生物量的增长与石油污染的降解密切相关[2, 34]，从体系中3株细菌在生长情况来看，迪茨氏菌S1-38在培养初期即大量生长，这可能是因为其他2株细菌通过产表面活性剂乳化了石油，刺激了S1-38的快速摄取利用，推测其在石油降解初期发挥主要作用；此后拉布伦茨氏菌S2-13和棒杆菌S1-30进入对数期；9 d后，由于细菌进入稳定期和衰亡期，石油降解产物也可能对细菌产生反馈抑制，反应体系中石油的降解较为缓慢，但由于S1-30生物量始终处于增长状态，对复合菌系SQ1持续降解石油起到一定的作用。
本研究分离到的石油降解菌全部来自近岸海域，与人类活动的关系更为密切，其环境适应能力较强。构成菌系SQ1的3株细菌中，棒杆菌和迪茨氏菌在海洋石油降解方面的作用已有所报道[22, 35]，但有关拉布伦茨氏菌的报道主要集中于降解利用氨基酸、产酶等方面[36, 37]，本研究是首次发现其在海洋石油降解方面的作用，有关3株细菌在复合菌系SQ1中的具体作用及代谢规律等，还需要做进一步研究。另外，由于海洋环境的复杂性，SQ1对石油污染的修复效果也有待现场试验加以证实。
4 结论从深圳近岸海域筛选得到22株高效石油降解菌，分布于副球菌、拉布伦茨氏菌、鞘氨醇盒菌、假单胞菌以及迪茨氏菌等菌属，实验室条件下，7 d内对石油的降解率最高为52.2%。
采用棒杆菌S1-30、迪茨氏菌S1-38和拉布伦茨氏菌S2-13由构建了高效石油降解复合菌系SQ1，对石油的降解率可达68.3%，比接种单菌高出16.1%。
SQ1的最适环境因素为30℃、石油浓度20 g/L、pH7.6。SQ1可降解石油大部分的烷烃组分，对长链烷烃的去除率几乎达到100%，在海洋石油污染修复中具有较强的应用潜力。
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