金黄色葡萄球菌是临床最常见的化脓性球菌，是医院交叉感染的主要来源^[1-3]。金葡菌感染能诱发多种疾病，且容易引发大规模爆发性感染，尤其是耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的多药耐药性和交叉耐药性给临床治疗带来极大的困难^[4-11]。目前，以万古霉素为代表的糖肽类抗生素是治疗MRSA感染的首选用药。但是，近年来，由于万古霉素的应用增加，陆续发现对万古霉素中介和耐药的金葡菌（VISA和VRSA）^[12-14]。因此，迫切需要开发与传统抗生素作用模式不同的新型抗菌药物。

溶葡萄球菌酶（lysostaphin，Lysn）是一种含Zn²⁺的金属蛋白酶，具有肽链内切酶活性^[15]，能特异性地水解金葡菌细胞壁肽聚糖交联结构甘氨酸五肽桥，从而产生破壁溶菌作用，具有极强的抗金葡菌活性^[16-18]。体外条件下rLysn清除金葡菌的作用非常快，在≥MIC水平（约0.03-0.125 µg/mL），对受试菌通常30 min 内可杀灭90%以上，2-4 h可杀灭99.9%以上^[19]。对MRSA也有同样显著的体外抗菌效果，并且优于糖肽类抗生素万古霉素^[20-22]。Lysn对金葡菌具有的快速溶菌作用，使得其成为国内外研发抗耐药金葡菌感染的热点^[23-25]。目前国内已经将重组溶葡萄球菌酶（recombinant lysostaphin，rLysn）研制成药用制剂，用于治疗皮肤创面金葡菌感染。

对rLysn成品中的蛋白含量测定，可以控制和评价rLysn成品的质量。由于rLysn在制剂制备过程中加入了人血白蛋白作为保护剂，常规的蛋白含量测定方法不适合成品中蛋白含量的测定。目前采用的C18柱反相高效液相色谱法测定rLysn成品蛋白质含量^[26]，但该法的分离效果不好，且洗脱程序复杂。本实验采用体积排阻高效液相色谱法（size exclusion-high performance liquid chromatography，SE-HPLC），测定rLysn成品中的蛋白含量，旨在高效分离rLysn和人血白蛋白，并简化实验流程，为提高rLysn成品质量标准奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品和标准品

rLysn理化对照品（蛋白含量为619 µg/支，批号：20120202）、rLysn成品（400 U/支，批号：20120801）、不含rLysn的空白制剂（安慰剂，批号：20120802），上海高科联合生物技术研发有限公司制备。

1.1.2 主要试剂及仪器

Agilent 1260 HPLC色谱仪，美国Agilent公司；色谱柱：TSK gel 2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5 µm），日本Tosoh公司；NaCl，Na₂HPO₄·1₂H₂O，NaH₂PO₄，分析纯，国药集团。

1.1.3 色谱条件

色谱柱：TSK gel 2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5 µm）；流动相：20 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）含0.3 mol/L NaCl；流速：0.5 mL/min；柱温：25℃；检测波长：280 nm。

1.2 方法 1.2.1 溶液的制备 1.2.1.1 对照品溶液

将rLysn理化对照品用超纯水溶解并稀释制成1 mg/mL和1.6 mg/mL的溶液。

1.2.1.2 供试品溶液

取rLysn成品1支，用1 mL超纯水溶解。

1.2.2 方法的验证 1.2.2.1 线性分析

取1 mg/mL理化对照品溶液，分别进样2、4、8、16和32 µL，按此进样量各重复进样2次，以进样量（µg）为横坐标，样品峰面积（S）为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，计算相关系数（r²）。

1.2.2.2 准确性验证

取1.6 mg/mL理化对照品溶液将空白制剂和rLysn成品溶解并稀释至理化对照品加标终浓度分别为0、0.2、0.4和0.8 mg/mL，每一浓度上样20 µL。计算加标回收率。按照上述方法重复测定3次。

1.2.2.3 精密度验证

用浓度为1 mg/mL的理化对照品溶液，采用体积法进样，分别进样4、8和16 µL，得到低、中、高3种进样量（4、8和16 µg）的峰面积。每一种进样量在不同工作日分别测定一次，计算每一种进样量的峰面积的均值、标准差和RSD。

1.2.3 稳定性

取同一份供试品溶液，每次上样20 µL，每小时进样1次，共6次，计算rLysn峰面积和RSD。

1.2.4 重复性

取同一批供试品溶液6份，分别进样1次，每次上样20 µL，计算rLysn峰面积和RSD。

2 结果 2.1 SE-HPLC色谱分析

rLysn理化对照品及rLysn成品的SE-HPLC色谱图（ 图 1 ）显示，rLysn和人血白蛋白的分离度大于2.5，表明本色谱方法能够满足成品中各组分达到基线分离。

2.2 方法的验证 2.2.1 线性范围

经5次进样，计算峰面积，结果见下表 1 ，得到的回归方程和相关系数分别为y=185.93x-2.0042，r²=1；y=189.46x-17.138，r²=1；y=188.49x-6.9125，r²=1。结果表明，rLysn在2-32 µg范围内与峰面积成良好的线性关系（注：后续数据均由回归方程Y=189.46x-17.138，r²=1得出）。

2.2.2 准确性

空白制剂加标回收率结果见表 2，3 种浓度的加标回收率在101.6%、103.8%和103.5%，平均回收率为102.9%，表明该测定方法准确性高。成品加标回收率结果见表 3，3 种浓度的加标回收率分别为105.8%、98.7%和101.8%，平均回收率为102.1%，进一步表明该测定方法准确性高。

2.2.3 精密度

3种不同上样量的rLysn理化对照品，分别于不同试验日进行精密度试验。数据取自3次标准曲线实验结果（ 表 4 ），RSD＜1%，表明该方法精密度高。

2.2.4 稳定性

取同一份供试品溶液，每小时进样1次，共6次，结果见表 4 ，RSD为0.98%，表明样品溶解后在6 h内稳定性良好。

2.2.5 重复性

取同一批供试品溶液6份，分别进样1次，共6次，结果见表 4 ，RSD为1.71%，表明该方法重复性良好。

3 讨论

rLysn对金葡菌具有良好的体外抗菌活性，且对甲氧西林敏感的金葡菌（MSSA）和MRSA有同样显著的抗菌效果。rLysn药用制剂，能有效治疗金葡菌感染，且不易产生耐药性^[27]。对rLysn制剂中主药蛋白即rLysn含量进行测定，能有效控制和评价制剂的质量。

由于rLysn冻干粉制剂中含有人血白蛋白，为了确定成品中rLysn的蛋白质含量，需要选用一种合适的方法，能够将rLysn与人血白蛋白有效分离，同时又能定量测定rLysn的蛋白质含量。根据两者分子量大小差异，采用体积排阻高效液相色谱法，将成品中的rLysn与其它作为保护剂的蛋白成分按照分子量大小进行分离。由于选择体积排阻高效液相法，洗脱程序变得简化，我们选择含氯化钠的磷酸缓冲液作为流动相。该方法在一定条件下，可以将rLysn和人血白蛋白有效分离，在2-32 µg上样量范围内，rLysn理化对照品上样量和峰面积之间呈现良好的线性关系，相关系数r²=1。因此，可以制备标准曲线，根据成品中rLysn的峰面积计算出成品中rLysn的蛋白质含量。

与RP-HPLC法相比，SE-HPLC法能更好的分离rLysn和人血白蛋白，该法的线性范围2-32 µg比RP-HPLC法的5-30 µg范围更宽，准确性比RP-HPLC法更好，精密度（RSD＜1%）远高于RP-HPLC法（RSD在3%-6%），且稳定性良好。在rLysn成品蛋白质含量测定上，SE-HPLC比RP-HPLC更加简便、准确，更适合用于rLysn成品蛋白质含量测定。

4 结论

本实验建立了一种测定rLysn成品蛋白质含量的SE-HPLC法，该方法简便、准确、重复性好。在该方法确定的测定条件下，可以将rLysn和人血白蛋白有效分离，并且以rLysn理化对照品作对照，在一定上样量范围内，可以对样品中的rLysn进行准确定量。该方法可用于rLysn成品蛋白质含量的测定，从而更好的控制和评价该制剂的质量。