CYP2C8是CYP2C家族中最晚发现的一个成员，大约占CYP2C家族的26%。 CYP2C8主要分布在肝脏，占肝CYP代谢酶总量的7%；其在肝脏外的组织中也存在少量的分布[1]。CYP2C8参与催化大约5%的临床药物，并且存在着明显的基因多态性，对药物的代谢清除有着明显的影响[2]。常见的CYP2C8基因多态性包括CYP2C8*2(805A＞T)、*3(416G＞A，1196A＞G)、*4(792C＞G)，其中CYP2C8*2只在非洲人中被发现，等位基因频率为19%，CYP2C8*3和CYP2C8*4只在白种人中被发现，等位基因频率分别为23.5%和5.8%，其他CYP2C8基因多态的频率较低[3]。目前已经知道CYP2C8的不同基因型对抗糖尿病药物[4]，抗肿瘤药物[5]，非甾体抗炎药[6]等药物的代谢过程有着重要的影响。
紫杉醇是一种抗微管细胞毒素药物，它通过促进微管蛋白聚合、抑制解聚、保持微管蛋白稳定、抑制细胞有丝分裂和促进肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。紫杉醇具有较广的抗癌谱，近年来被广泛应用于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、头颈部癌等恶性肿瘤[7-9]。紫杉醇在人体内能够被CYP3A4和CYP2C8代谢，分别生成p-3′-羟基紫杉醇和6α-羟基紫杉醇[10, 11]。在人肝微粒体中，6α-羟基紫杉醇的生成量高于p-3′-羟基紫杉醇，表明CYP2C8在紫杉醇体内代谢清除过程中扮演着重要角色[12]。为了达到更好的治疗效果，紫杉醇经常与一些小分子激酶抑制剂等新型抗肿瘤药物联合使用，以使抗肿瘤功效最大化。虽然联合疗法已较多报道，但是紫杉醇在与这些小分子激酶抑制剂联用时，药物之间的相互作用目前还鲜有报道。因而有必要研究清楚各种小分子激酶抑制剂及药物对酶的抑制作用。
在不同的病人体内，紫杉醇的药代动力学的变化各不相同，这种变化与CYP3A4和CYP2C8表达及酶活性的不同有着紧密的联系。近年来也进行了大量的实验研究CYP酶的多态性，以及它们与个体化差异的关系在紫杉醇的药效和毒性中起到的作用[13]。例如，CYP2C8*3与高效的临床反应以及神经毒性风险的提高有关[14-16]。CYP3A4*22基因型能够影响有紫杉醇引起的神经毒性[17]。这些都表明不同基因型的CYP酶对紫杉醇的代谢情况存在差异，这些差异将会影响到紫杉醇的抗癌作用和毒副作用。而本课题将研究紫杉醇在不同基因型的CYP2C8代谢酶中的代谢情况。
为了更好地研究紫杉醇与CYP2C8、CYP3A4代谢酶以及小分子激酶抑制剂的关系，需要构建一个合适的系统。目前常用的系统有细菌表达系统[18]、酵母表达系统[19]、昆虫表达系统[20]和哺乳动物表达系统[21]。P450酶在不同的表达系统中有着各自的表达特点。最终，本研究选择了哺乳动物表达系统——HepG2细胞株。HepG2细胞株与其它主要的人肝细胞相比，更加的经济和使用方便。由于它来源于原发性肝癌的活体组织，保留了许多外源性物质的P450代谢活性[22]，但CYP酶活性较低[23]，更为重要的是HepG2细胞内含有P450酶催化活性所必需的CYP450 氧化还原酶和细胞色素b5等辅助因子[24]。因此它是用来研究CYP450介导药物代谢的一个理想的系统[25]。通过P450酶表达系统，可以避免体内药物研究存在的安全性低，通量低，易受外界条件影响等缺点[26]，从而能够更加准确的研究药物之间相互作用以及不同的基因型对药物的代谢的影响，为临床用药安全提供更多的参考和更好的保障。本研究利用生物合成学的方法，构建CYP2C8及其3种突变体细胞表达体系，以紫杉醇为底物研究CYP2C8基因多态性对其酶活性的影响，以及构建CYP2C8和CYP3A4共转染细胞体系研究小分子激酶抑制剂对紫杉醇代谢途径的抑制，以期为临床给药提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 材料HepG2细胞购自上海生物化学与细胞生物学研究所；FBS(胎牛血清)、DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基、链霉素、青霉素以及PBS缓冲液购自Hyclone公司；胰蛋白酶购自Gibco公司；脂质体2000试剂购自Invitrogen公司；甲醇、乙腈购自Merck公司；紫杉醇、6α-羟基紫杉醇、p-3′-羟基紫杉醇以及多西紫杉醇购自美国Sigma公司；阿法替尼、伊马替尼、尼洛替尼购自上海ChemBest公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养采用含10% FBS和1%双抗(青霉素及链霉素)的DMEM高糖培养基进行培养，培养条件为37℃、5% CO2、饱和湿度。
1.2.2 质粒构建根据NCBI GENE(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)文库，利用合成生物学方法合成CYP2C8和CYP3A4基因，与载体pEGFP-N1进行组装、测序，以上步骤由金唯智公司(http://www.genewiz.com.cn/)完成。测序正确后进行功能验证。
1.2.3 细胞转染参考产品说明书，将一定浓度的质粒稀释至50 µL不含血清和抗生素的RPMI-1640培养基中，2 µL脂质体2000悬液加入50 µL不含血清和抗生素的RPMI-1640培养基中，在室温孵育5 min。然后将含质粒的RPMI-1640培养基和含脂质体2000的RPMI-1640培养基混合在一起，并充分混匀，静置20 min，使得含质粒的载体和脂质体能够充分的混合。同时准备好只加入了脂质体2000的RPMI-1640培养基，作阴性对照；吸去600 µL接种到24孔板中的培养液，每孔加入100 µL上述混合物，阴性对照孔加入400 µL新鲜培养基及100 µL只加入了脂质体2000的RPMI-1640培养基。经4 h后，吸弃24孔板中的转染培养液，同时向各孔加入1 mL的含有血清不含抗生素的DMEM培养基，继续培养。
1.2.4 活性测试细胞转染48 h之后，用KHB缓冲液清洗细胞两次。用KHB缓冲液配制浓度为5 µmol/L的紫杉醇作为探针底物，每孔500 µL进行孵育。4 h后，取出24孔板，每孔吸取100 µL KHB孵育液，加入到含有内标的100 µL有机溶剂中。振荡2 min后，1.3×104 r/min 4℃离心10 min，吸取上层清液进行LC-MS/MS分析。具体过程见图 1 。
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| 图 1 合成CYP2C8和CYP3A4基因，与载体同源重组以及功能测试 |
细胞铺板24 h后进行细胞转染。细胞转染48 h后进行活性测试实验，在活性测试实验中，用KHB缓冲液将各个小分子激酶抑制剂配制到临床使用浓度，并于活性测试时与底物同时加入。将每孔细胞进行裂解，测定蛋白浓度，并利用蛋白浓度来对活性测试结果进行校准。
1.2.6 LC-MS/MS分析CYP2C8和CYP3A4的代谢产物通过LC-MS/MS系统来进行定量分析。美国Applied Biosystems公司API 4000 Q Trap三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子源(Turbo IonSprav)，高效液相分离包括LC-20AD泵，CBM-20A控制器，SIL-20A自动进样器，Shimadzu CTO-20A柱温箱。电离源为ESI源，正离子方式检测，喷雾电压为5.5 kV，雾化温度为500℃，气帘气CUR为20 L/min，辅助气AUX(GAS2)为65 L/min。扫描方式为多反应监测(MRM)。采用Agela Venusil XBP C18 色谱柱(50×2.1 mm；5 μm)实现代谢物分离，柱温40℃，流速为0.3 mL/min，流动相为A相(水∶乙腈=95∶5)与B相(水∶乙腈=5∶95)梯度混合。
2 结果 2.1 LC-MS/MS检测方法建立紫杉醇代谢物(6α-羟基紫杉醇和p-3′-羟基紫杉醇)专属灵敏的LC-MS/MS方法，进行定量检测。采用正离子模式，选择离子对m/z 892.4→324.1、m/z 892.3→308.1和m/z 830.3→549.4分别测定p-3′-羟基紫杉醇、6α-羟基紫杉醇和多西紫杉醇(内标)的含量；色谱图如图 2 所示。代谢物与内标实现基线分离，峰形良好，无干扰。
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| 图 2 紫杉醇代谢物LC-MS/MS色谱图 |
为了研究CYP2C8的不同基因型对紫杉醇代谢的影响，分别构建了CYP2C8野生型质粒(WT)和3种突变型质粒，包括*2(805A＞T)、*3(416G＞A，1196A＞G)和*4(792C＞G)。分别将其转入HepG2细胞后进行功能测试，结果如图 3 所示。转染了CYP2C8野生型及不同基因型质粒后，6α-羟基紫杉醇的生成量显著增加，且在不同的CYP2C8基因型细胞之间，6α-羟基紫杉醇的生成量存在差异。其中CYP2C8 *2和*3代谢活性分别是野生型的81%(P＜0.05)和87%(P＜0.05)，而*4则仅为野生型的65%(P＜0.01)。
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| 图 3 转染CYP2C8不同基因型质粒的HepG2细胞的6α-羟基紫杉醇生成量 与WT（野生型）比较*P＜0.05，**P＜0.01；NC：阴性对照；Lip：脂质体；WT：野生型 |
紫杉醇能够同时被CYP2C8和CYP3A4代谢生成6α-羟基紫杉醇和p-3′-羟基紫杉醇。HepG2细胞中同时转入不同比例的CYP2C8和CYP3A4后的功能测试结果如图 4 所示。转染了CYP2C8和CYP3A4的细胞中的代谢产物生成显著增加，并且随着CYP2C8比例的提高，6α-羟基紫杉醇生成量与p-3′-羟基紫杉醇生成量之比也随之升高。同时，当CYP3A4与CYP2C8质粒浓度比为1∶5时，CYP3A4 和CYP2C8参与紫杉醇代谢比例(活性比)与体外人肝微粒体结果相似[13]，因此用该转染比例进行后续的抑制试验。
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| 图 4 不同浓度比的CYP3A4和CYP2C8质粒，6α-羟基紫杉醇和p-3′-羟基紫杉醇的生成量 NC：阴性对照；Lip：脂质体。与NC（阴性对照）比较***P＜0.001；6α-羟基紫杉醇与p-3′-羟基紫杉醇生成量的比值标注在柱形图上方 |
CYP3A4和CYP2C8质粒浓度比为1∶5时(对照组)，小分子激酶抑制剂阿法替尼、伊马替尼和尼洛替尼对紫杉醇代谢途径的抑制结果如图 5 所示。结果显示，尼洛替尼完全抑制了紫杉醇的代谢，阿法替尼对紫杉醇的两条代谢途径抑制达30%，而伊马替尼选择性抑制了CYP3A4的活性。
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| 图 5 阿法替尼、伊马替尼、尼洛替尼对紫杉醇代谢的抑制 与对照组比较：**P＜0.01；***P＜0.001 |
体外药物代谢研究通常以肝微粒体、胞浆、S9或原代肝细胞等为主要体系。较之肝微粒体，原代肝细胞存在着来源、质量、较大的个体差异等不利因素。因此，构建稳定可控的体外细胞代谢体系，不仅可以避免原代肝细胞的各种缺陷，同时也会较大提高研究及药物筛选的效率。合成生物学具有简单准确等优势，可以将目标基因(如CYP同工酶)构建成相对应的质粒并转染至细胞中，进行表达，获得单一的高表达的CYP酶或者按照一定比例的不同的CYP酶的共表达体系，从而能够更加准确、便捷地进行药物代谢研究。
代谢研究的另一个挑战是代谢酶的基因多态性。基因多态性是指同一人群的同一基因位点上存在多个等位基因形态，并且遵循孟德尔遗传定律[26]。由于超过半数以上的药物都是由CYP450介导代谢的，CYP450的基因多态性已经成为造成药物反应个体差异的主要原因。本研究以CYP2C8为目标，合成了CYP2C8*1、*2、*3 及*4的关键基因，构建了独立的HepG2表达体系。在研究过程中，我们发现转染了CYP2C8质粒的细胞的6α-羟基紫杉醇的生成量与空白和只加了脂质体2000的细胞相比具有显著的增加，同时在转染了CYP2C8野生型和突变体质粒的细胞中，6α-羟基紫杉醇的生成量存在着差别。这些结果说明了构建的细胞表达体系具有代谢功能，不同基因型CYP2C8对紫杉醇的代谢作用存在着“基因剂量”的影响。
作为临床上常用的经典抗癌药物，紫杉醇能够同时被CYP3A4和CYP2C8代谢。由于捐献者之间的基因差异，健康状况和用药历史的不同，肝微粒体中P450酶的活性也不相同，紫杉醇的代谢产物6α-羟基紫杉醇和p-3′-羟基紫杉醇生成量的比值也不相同[27]。在我们之前的研究中，6α-羟基紫杉醇的生成量大约是p-3′-羟基紫杉醇的9倍。这说明尽管CYP2C8在肝中的表达量低于CYP3A4，但其在紫杉醇的代谢清除中起主导作用。甚至在有些捐献者的肝微粒体中，6α-羟基紫杉醇的生成量能达到p-3′-羟基紫杉醇的13倍[12, 28]。在胆汁和尿液中，6α-羟基紫杉醇的生成量能达到p-3′-羟基紫杉醇的4倍，紫杉醇引起的神经毒性的程度和CYP2C8的活性以及6α-羟基紫杉醇的生成量一致。这说明P450酶介导的紫杉醇代谢是影响其临床药效的主要因素，因此应该重视药物与药物之间的相互作用，并寻求基于紫杉醇的联合疗法来达到更好的治疗效果。
由于紫杉醇能够同时被CYP3A4和CYP2C8代谢，所以本研究选择紫杉醇作为一个合适的探针底物来研究药物对CYP2C8和CYP450抑制作用。本实验中，我们成功构建了CYP2C8和CYP3A4的HepG2的双转体系，并验证了其代谢功能，在该HepG2的双转细胞中，根据p-3′-羟基紫杉醇和6α-羟基紫杉醇的生成量可以反映CYP3A4和CYP2C8的代谢活性。我们发现当转入的CYP3A4与CYP2C8质粒比为1∶5时，CYP3A4 和CYP2C8参与紫杉醇代谢比例与体外微粒体实验结果相似。故选择1∶5的比例构建的细胞表达系统来模拟肝微粒体体系，研究小分子激酶抑制剂对P450酶的抑制作用，来进一步探究体内药物与药物的相互作用。临床上使用紫杉醇时常与其他抗肿瘤药物联合使用，产生了一系列的药物相互作用，因此进一步的体内研究可集中于以紫杉醇为基础的更安全有效的联合疗法。而在癌症治疗中，临床上已有超过10种以上的小分子激酶抑制剂与紫杉醇进行联用，而与这些小分子激酶抑制剂进行联用时的相互作用还鲜有报道。本实验选用了临床上已使用的3种小分子激酶抑制剂：尼洛替尼、阿法替尼和伊马替尼进行抑制研究。CYP2C8和CYP3A4酶活性的改变能够导致代谢产物生成量的改变，这些改变将会影响基于紫杉醇的联合疗法的疗效和风险。实验中我们发现，尼洛替尼完全抑制了紫杉醇代谢途径，阿法替尼部分抑制了紫杉醇代谢途径，而伊马替尼选择性抑制了CYP3A4的活性，但具体的作用机制还需要进一步的研究。
由于药物与药物相互作用以及个体之间的差异，在制定临床给药方案时需要考虑的因素也越来越多。我们需要更加着重于药物之间的相互作用以及个体差异对药物代谢的影响并以此给临床用药提供正确的指导，提高药效，降低风险。
4 结论本研究通过运用生物合成技术，成功构建了CYP2C8及其3个变异体以及CYP3A4体外表达体系，以紫杉醇为底物研究了基因多态性以及小分子激酶抑制剂对酶活性的影响，其中CYP2C8 *2、CYP2C8 *3、CYP2C8 *4活性分别为野生型活性的81%、87%和65%；而在抑制实验中，尼洛替尼完全抑制了紫杉醇的代谢，阿法替尼对紫杉醇的两条代谢途径抑制达30%，而伊马替尼选择性抑制了CYP3A4的活性。
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