骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）是骨髓造血微环境的重要组成部分，除具有支持与调控造血功能外，还具有成骨、成脂和软骨形成等多向分化能力，是目前骨组织工程广泛使用的主要细胞来源，可用于多种骨骼疾病的临床治疗，在其他组织器官损伤修复过程中也具有广阔的应用前景^{[1, 2]}。BMMSCs的分化受多种因素调控，表观遗传作为BMMSCs分化的主要调控机制之一，在决定其分化方向上起到重要作用。

表观遗传是能够调控基因表达但不改变相关基因序列的可遗传的修饰。表观遗传调控BMMSCs分化相关基因的时空表达，在一定程度上代表BMMSCs的多能性。同时，表观遗传状态的改变也能影响BMMSCs的分化方向及能力^[3]。常见的表观调控主要包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化和非编码RNA调控等，本文拟从以上几方面介绍近年来BMMSCs分化过程中表观遗传调控的相关研究进展。

1 组蛋白修饰 1.1 组蛋白乙酰化修饰

组蛋白乙酰化修饰是在组蛋白N端赖氨酸残基上添加乙酰基团，是最常见的表观遗传修饰之一。组蛋白乙酰化能够促进染色质结构开放从而使基因转录活化，组蛋白去乙酰化则与染色质转录抑制相关。组蛋白乙酰化水平主要受组蛋白乙酰基转移酶（histone acetylase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（hi-stone deacetylase，HDAC）的调控^[4]。

相关调控基因的组蛋白乙酰化程度可反映BMMSCs的干性维持及分化状态，H3K9和H3K14的乙酰化（H3K9ac，H3K14ac）是基因活化的标志。在BMMSCs成骨分化过程中，成骨相关基因RUNX2和ALP的表达逐步上调，而干细胞自我更新相关的干性因子Oct4和Sox2表达显著下降，它们的表达变化与H3K9ac和H3K14ac密切相关^[5]。

根据HDAC结构域的同源性可将其分为4类。在现有研究中，第I类的HDAC1、HDAC8及第III类的SIRT1在BMMSCs的分化选择中发挥了重要的作用。在心肌微环境下，BMMSCs可以分化形成心肌细胞，在该过程中，HDAC1的表达显著下降，同时，敲低HDAC1能够促进BMMSCs直接分化为心肌细胞^[6]。HDAC8通过抑制H3K9的乙酰化及RUNX2的活性，使大鼠BMMSCs向成骨分化的程度降低^[7]。 SIRT1则可直接调控干性因子Sox2来维持BMMSCs的自我更新和多能性，其活性的降低使Sox2表达下调，从而导致BMMSCs自我更新能力和分化能力的退化，活化的SIRT1则以剂量依赖的方式促进BMMSCs克隆形成能力和成骨成脂分化能力^[8]。同样，SIRT1可通过去乙酰化β-catenin使其在核内累积进而调控BMMSCs分化相关基因的转录^[9]。此外，SIRT1可通过活化Sox9和NF-κB的去乙酰化，促进BMMSCs的软骨分化过程^[10]（图 1 右）。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对BMMSCs的分化有很强的影响。用组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸（VPA）和丁酸钠（NaBu）处理BMMSCs可增加组蛋白H3和H4乙酰化水平，显著促进肝脏特异基因的表达，这提示去乙酰化酶抑制剂促进BMMSCs向肝脏方向的分化^[11]。同时，NaBu可抑制大鼠BMMSCs中HDAC2的表达及其在平滑肌特异基因上的募集，进一步诱导高水平的H3K9ac和H4ac，促进平滑肌特异基因的表达，诱导BMMSCs向平滑肌方向分化^[12]。另外一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA，可显著抑制干性因子Oct4、Sox2及Nanog的下调，以稳定BMMSCs中多能性基因的表达^[13]。其他研究发现，TSA处理增加了组蛋白H3的乙酰化水平并抑制了BMMSCs成脂分化^[14]（图 1左）。

1.2 组蛋白甲基化修饰

组蛋白甲基化是另一种常见的组蛋白翻译后修饰。组蛋白可以发生单甲基化、双甲基化或三甲基化。甲基化的增加通常能够促进组蛋白与DNA的亲和力，增加转录抑制的程度，例如H3K9me和H3K27me。然而也有一些重要的例外，如H3K4的甲基化常与活化的染色质相关，而H3K9三甲基化依赖于不同的基因对染色质状态有不同的调控作用。组蛋白甲基化受组蛋白甲基转移酶（HMT）和组蛋白去甲基化酶（HDM）共同调控^[4]。

研究发现，组蛋白甲基化修饰酶能够调控BMMSCs的分化能力。甲基转移酶EZH2，可以三甲基化染色质H3K27，而这种抑制性的表观遗传标记能够被去甲基化酶KDM6A去掉。Hemming小组^[15]发现，EZH2的高表达能够促进BMMSCs的成脂分化，抑制成骨分化，KDM6A则有相反的作用，两者通过影响关键调控基因启动子区H3K27me3的水平来调控BMMSCs分化的特异性。精氨酸甲基转移酶CARM1，可通过组蛋白甲基化介导的染色质重塑调控基因表达，该因子进入细胞核后，可对H3R17进行甲基化，提高BMMSCs的体外成脂分化、成骨分化及成肌分化的能力^[16]。

胚胎干细胞中的关键基因位点同时包含活化的组蛋白修饰标记（如H3K4me3）和抑制性的组蛋白修饰标记（如H3K27me3），这两种修饰使基因处于一种抑制性但可以被迅速活化的状态^[3]。这些位点上表观遗传修饰的状态可决定相关基因的最终命运。在未分化的BMMSCs中，c-Myc和cyclin D1（Wnt/β-catenin信号通路的靶点）基因上与β-catenin相结合的启动子区同时具有抑制状态及活化状态的染色质标记，在BMMSCs向成骨分化过程中，启动子区含有活化的染色质标记H3K4me，而抑制性标记H3K27me3缺失，与之相反，在BMMSCs成脂分化过程中，启动子区则仅有抑制性的H3K27me标记^[17]。

2 DNA甲基化

DNA甲基化是DNA化学修饰的一，在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。哺乳动物的DNA甲基化主要是在C-G二核苷酸（CpG）上共价添加甲基基团，具有靶向特异性，是最重要的沉默性表观遗传修饰之一。目前已发现的所有CpG岛的DNA甲基化几乎都沉默了相关基因，DNA甲基化抑制剂5-Aza可使基因表达很大程度上得以恢复。DNA甲基转移酶蛋白家族（DNMTs）与可能的DNA去甲基化酶协同调控DNA甲基化水平及相关基因的表达^[4]。

DNA甲基化状态的改变关系到细胞分化命运的转换。5-Aza导致的整体甲基化水平的改变抑制了BMMSCs的增殖和成脂分化^[14]，促进其成骨分化、向神经元样细胞、心肌细胞或骨骼肌细胞的分化^[18]。应用靶向DNA甲基化技术将BMMSCs中Trip10甲基化，其分化潜能受到限制，促进了BMMSCs向神经及成骨方向分化，阻断了BMMSCs的成脂分化，说明Trip10的甲基化对BMMSCs分化方向的诱导具有特异性^[19]。肿瘤抑制基因HIC1 和RassF1A的靶向甲基化促使BMMSCs转化成肿瘤干细胞样细胞，转化的BMMSCs仍然能分化成不同的细胞类型，包括成骨细胞、神经细胞和脂肪细胞，同时，HIC1 和RassF1A定向甲基化后，少量转化的BMMSCs使免疫缺陷的小鼠快速产生肿瘤，这也提示DNA的异常甲基化可导致肿瘤发生^[20]。

3 非编码RNA 3.1 长链非编码RNA

长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一类转录长度大于200 bp的非编码RNA，能够在转录及转录后水平调控基因表达，是表观遗传调控研究的另一个热点。人类的lncRNA有大约30 000条不同的转录本，是非编码转录组的主要组成成分，绝大部分lncRNA的功能尚不清楚。近年来，一些研究证实lncRNA在BMMSCs分化调控中也发挥了重要作用。Wang等^[21]报道，在BMMSCs向软骨方向分化过程中，lncRNA ZBED3-AS1 和 CTA-941F9.9表达显著上调，并在分化28 d后仍呈高水平表达，提示它们可能参与了BMMSCs的软骨分化过程。在BMMSCs成骨分化过程中，lncRNA-ANCR（anti-differentiation ncRNA）表达显著降低，lncRNA-ANCR通过与EZH2结合抑制Runx2的表达，进而抑制BMMSCs的成骨分化，抑制内源lncRNA-ANCR的表达则促进了成骨分化^[22]。此外，有研究报道lncRNA H19和uc022axw.1的上调表达可能也参与了BMMSCs的成骨分化^[23]。这些研究结果表明lncRNA也是BMMSCs分化的一种重要调控因子，为骨相关疾病的治疗提供了新的靶点。

3.2 微小RNA

微小RNA（microRNA）是一类长度为21-25 nt的内源性非编码单链RNA，可通过碱基互补配对的方式与靶mRNA特异结合，剪切靶基因的转录产物或抑制其翻译。miRNA也参与了基因的表观遗传调控，在BMMSCs的干性维持和多分化方向的过程中发挥了重要作用。miRNA-133a能够促进BMMSCs向心肌细胞的分化^[24]。而miRNA-124通过与STAT3的3′-UTR的靶向结合，抑制STAT3的翻译，使BMMSCs向心肌细胞分化的能力减弱^[25]。此外，miRNA-9与β-巯基乙醇协同诱导BMMSCs向神经方向分化^[26]。miRNA-29a/b及miRNA-449a可抑制BMMSCs向软骨方向的分化^[27]。miRNA-155，miRNA-221/222则在BMMSCs的成脂分化过程中发挥了重要的负调控作用^[28]。

4 表观遗传修饰的网络调节

在生物体复杂精细的内环境下，表观遗传调控往往也不是以单一的方式发挥作用的，不同的组蛋白修饰之间可以相互影响，协同发挥作用，组蛋白修饰也可以与DNA甲基化相互偶联，从而产生复杂的表观遗传效应。表观遗传修饰的网络调节模式也参与了BMMSCs分化的精细调控。

BMMSCs的成骨分化和成脂分化之间的平衡受C/EBPα启动子区的DNA甲基化和组蛋白乙酰化的协同调控，在成骨分化的末期，C/EBPα启动子区域的高甲基化阻止了PPARγ的结合，HDAC1进一步结合到该区域，降低组蛋白乙酰化水平，PPARγ在C/EBPα的启动子区建立了DNA甲基化和组蛋白乙酰化的桥梁^[29]。组蛋白修饰因子YY1与转录共激活因子p300可通过对组蛋白乙酰化水平的调控改变BMMSCs中软骨特异基因ChM-I的表达，在启动子区低甲基化的细胞中抑制YY1并增加p300和基本转录因子Specificity protein3（Sp3）的表达能够维持ChM-I的表达，但在高甲基化的细胞中并没有这种作用，说明在BMMSCs软骨分化过程中，ChM-I受组蛋白去乙酰化和组蛋白甲基化的协同负调控^[30]。BMMSCs在成骨分化过程中RUNX2表达上调，同时转录活化相关的H3K9ac和H3K4me3修饰水平及在RUNX2启动子区的募集均有升高，而与转录抑制相关的H3K9me3修饰水平及在RUNX2启动子区的募集降低，RUNX2启动子区DNA甲基化修饰程度降低^[31]。这些研究结果说明，不同的表观遗传修饰之间可以协同作用调控BMMSCs的分化过程。

5 骨髓间充质干细胞分化过程中的表观遗传组学研究

近年来，系统性高通量的研究方法比如染色质免疫共沉淀结合高通量测序ChIP-seq（chromatin immunoprecipitation with deep sequencing）和芯片ChIP-on-chip（chromatin immunoprecipitation assay）技术的广泛应用有助于从基因组整体水平研究表观遗传修饰的状况，建立BMMSCs分化过程的表观遗传谱。

Herlofsen 等^[32]应用ChIP-Seq研究了来源于4个捐赠者的hBMMSCs体外软骨分化前后7 d的染色质表观遗传谱，分析了6种组蛋白修饰（H3K4me3，H3K9ac，H327me3，H3K36me3，H3K4me1，H3K27ac）在整体基因组上的变化情况，并用亚硫酸氢盐修饰后测序法检测DNA甲基化和mRNA芯片检测基因表达情况。结果表明，分化过程中上调的基因与软骨形成密切相关。在其基因体（gene bodies）区发生了与转录延伸相关的H3K36me3修饰，在基因的启动子区和5′末端区域活化染色质标记H3K4me3和H3K9ac水平大幅增加，每个上调表达的基因在至少一个增强子区域的H3K27ac和H3K4me1修饰增加，这两种修饰也是活化染色质的标记。在7 d的时间范围内启动子区的DNA甲基化改变与基因表达的变化并不显著相关。

此外，Tan 等^[33]应用ChIP-on-chip技术在全基因组水平研究hBMMSCs的基因启动子区H3K9ac和H3K9me2修饰状况，结果表明在hBMMSCs中基因启动子区H3K9的修饰与mRNA的表达相关性很好，功能分析显示在hBMMSCs自我更新中多种关键的胞内信号转导途径能够被H3K9的修饰调控。而在hBMMSCs成骨分化过程中，H3K9ac在基因启动子区的整体富集逐渐降低，H3K9me2的整体富集升高^[34]。这些结果表明H3K9ac和H3K9me2影响的基因活化和沉默可能对hBMMSCs的自我更新、多能性维持及成骨分化至关重要。

6 展望

表观遗传调控参与了多种细胞发育和分化过程，也是BMMSCs分化的主要调控机制。近年来已发现多种参与BMMSCs分化的表观遗传修饰，在此基础上，研发有效调控这些修饰的药物，为BMMSCs提供精确的分化条件，使BMMSCs能够向可控可预测的方向分化。除了文中介绍的组蛋白修饰类型外，组蛋白磷酸化、泛素化等修饰在BMMSCs分化中的作用也有待深入研究。此外，随着BMMSCs体外培养代数的增加，DNA复制、细胞周期和成脂分化相关基因甲基化水平升高^[35]。这些因素对BMMSCs的衰老有重要影响，因此对DNA甲基化的合理调控是抑制BMMSCs衰老，使之更有效的应用于临床治疗的一种方法。这些研究成果对其他组织来源的间充质干细胞，如脂肪和脐带血来源的间充质干细胞的分化机制研究及临床应用也有重要的参考价值。BMMSCs的异常分化可导致肿瘤及其他一些疾病的发生，表观遗传调控的异常是其主要原因之一^[3]，表观遗传修饰试剂作为分化诱导剂的应用对选择性癌症治疗是很重要的，它侵入性更低，并对癌细胞有更高的选择性。表观遗传治疗的缺点是缺乏特异性，目前能够调控干细胞分化和增殖的小分子药物已在检测和开发阶段，可调控观编程和发育信号途径的各个方面^[36]。

综上所述，表观遗传在BMMSCs的多能性维持和分化过程中发挥了重要的调控作用，但具体机制尚不完全明了，新的调控修饰有待发现。这个领域的深入研究必将为提高BMMSCs的定向分化效率提供线索，在临床组织工程和细胞移植领域有广阔的应用前景。