落地生根(Kalanchoë daigremontiana)又名土三七、打不死、叶生根等，属于景天科(Crassulaceae)伽蓝菜属，为多年生肉质草本植物。起源于马达加斯加岛，其分布广泛，遍及马达加斯加、东非和南非，延伸至热带非洲、阿拉伯半岛和东南亚[1]，并广泛分布于我国广东、广西、云南、福建和台湾等地。落地生根形态奇特且极易栽培，具有较强的观赏性。此外，落地生根具有较高的药用价值，常用于治疗皮肤病、呼吸系统疾病、脑部疾病等，还可制备抗菌消炎药剂等[2]，对关节肿痛、热性胃痛、跌打损伤等具有良好的疗效[3]。
众所周知，落地生根具有很强的再生能力，属营养体胎生植物类型。其在叶片凹陷处形成胎生苗，胎生苗根系成熟后便与母体分离，形成新的独立植株，进行无性繁殖。落地生根产生胎生苗的周期短、数量大，且同步性较强，容易成活，是无性繁殖的好材料[4]。
落地生根在结实环境外形成体细胞胚的能力，从本质上为研究体细胞胚的发生提供了具有吸引力的模式系统。而落地生根的植物体细胞具有显著的生成完整有机体的能力，科学界对这种非凡的再生能力已感兴趣多年[5]。目前，国内对落地生根的研究多集中于化学成分[6-8]、药用价值[9, 10]等方面，而对胎生苗发育及其相关基因方面的研究较少。因此，本文就目前对落地生根胎生苗的发育过程以及基因控制等方面的研究进行综述，以期为相关研究提供一定的参考。
1 胎生苗的形态发生 1.1 胎生苗简介在植物界中，有一类植物在种子脱离母体前便萌发为幼苗，或者在母体的营养器官或繁殖器官上直接分化出幼苗，幼苗与母体自然脱落、长成新的植株，这类植物统称为胎生植物。其中，称前者为种子胎生或真胎生，后者为营养体胎生或者假胎生[11, 12]。产生于母体的幼苗统称为胎生苗。在我国40种营养体胎生植物中，大多数珠芽和鳞芽产生于茎上，而落地生根的胎生苗产生于叶缘凹陷处，具有一定的特殊性[4]。
尽管进行了广泛的调查研究，叶片胎生苗的特性仍然存在一定的争议，这导致其术语的多样性。胎生苗被定义为“芽”、“胚”或“叶胚”、“叶的假珠芽”、“胚状体”、“叶的分生组织”、“不定芽”、“叶附生芽”等。Warden[13]在对当时广泛应用的术语进行回顾的基础上，得出尽管叶片胎生苗发育中形成类似胚的结构，但由于缺少两极性，具有闭合的维管系统且独立于母体外，因此胎生苗并不是真正的胚。同时胎生苗也不是芽，芽发育为正常的叶片，而胎生苗在形态学上由类似子叶的特殊结构发育而来。因此，Warden[13]结合当时的信息认为对胎生苗描述最恰当的术语为“叶苗分生组织”。此后，Batygina等[14]对落地生根和羽叶垂花树(K. pinnata)的叶片胎生苗进行了形态学和组织学研究，得出胎生苗是“叶的胚”或“胚”。目前为止，有关胎生苗的特性及其形态发生的证据并不完全，因此任何结论的得出都需要做进一步的研究分析。
1.2 胎生苗的发育过程落地生根通过在叶片上形成胎生苗而进行无性繁殖。落地生根的叶片呈卵圆、椭圆或长三角形，对生，肉质多汁，具有带锯齿状的叶缘。胎生苗形成于成熟叶片的叶缘凹陷处，它们并不是同时形成的，而是从每片叶片的叶尖逐渐延伸到叶片基部，对称地沿着叶缘发育[15]。在伽蓝菜属的其他物种中也发现了类似的生殖模式，自20世纪起科学界对此便很感兴趣[14-17]。
Batygina等[14]和Garcês等[15]先后详细描述了落地生根胎生苗的发育过程，袁强等[4]对胎生苗的发育进行了解剖学研究。结合前人的研究成果，对胎生苗的发育过程进行描述和总结。在叶片胎生苗发育的早期阶段，由于它由单个或几个细胞组成，并且叶缘的凹陷以及凹陷中的突起与之同时发育，因此很难识别这个阶段的胎生苗[14, 15]。在形态学上，胎生苗发育第一阶段的证据是形成了1.5 cm长的圆顶状突起，类似于球形胚和芽分生组织。随后，胎生苗发育经过类似心形胚阶段，并发育出类似子叶的叶片[15]。众所周知，合子胚的发育经过球形胚、心形胚和鱼雷胚的阶段，最后发育为成熟胚。落地生根胎生苗的发育类似于合子胚，在其发育过程中可区分出类似的阶段[14]。胎生苗的叶片为对生，由叶缘凹陷中的突起发育而来，在形成初期，两片叶片一大一小，但在随后的发育中叶片大小逐渐变得几乎相等[14, 18]。胎生苗两片叶片之间存在有叶原基，在随后的发育中形成对生的两片小叶。叶片在发育中形成大量叶绿体和淀粉等储能物质[14, 4]，并形成完整的维管系统。发育完全的胎生苗四枚叶片两两对生，相互交错排列为圆球状，并在顶端保留生长点[4]。胎生苗叶片发育完成后至其脱离母体前，在其下胚轴基部形成不定根[14, 15]。待根系成熟后，胎生苗与母体脱离，遇到适宜环境迅速长成新的独立植株。胎生苗发育成熟后与母体脱离，是由于叶片的基座细胞程序性死亡形成了离层[5]。
1.3 胎生苗发育的特性Batygina等[14]认为胎生苗在发育过程中可区分出类似于合子胚发育的各个阶段，胎生苗叶片的形成与合子胚的子叶类似。Garcês等[15]进行共焦成像显示：胎生苗与胚类似，在发育的所有阶段均具有独立于母体的闭合维管系统。Batygina等[14]却认为胎生苗维管系统与母体有短暂连接，但不能以此认定胎生苗为芽。然而，胎生苗与胚不同，不形成主根和芽尖，而是在下胚轴基部形成不定根，这与芽相似[14, 15]。基于胎生苗这些形态特征同时类似于芽和胚，Garcês等[5]得出落地生根胎生苗的形成同时结合了器官发生和胚胎发生(图 1)。袁强等[4]对落地生根胎生苗发育进行解剖学观察发现：胎生苗形成于叶缘凹陷处具有一定的特殊性，胎生苗叶片与不定根的分化具有时序性，以及胎生苗有易落和易繁性。
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| 图 1 落地生根与胎生苗 A：落地生根植株；B：发育完全的胎生苗；C：胎生苗在叶片上逐个发育；D：胎生苗出现类似子叶的叶片；E：类心形胚阶段的胎生苗 |
尽管形态学和解剖学研究提供了关于胎生苗发育的详细的描述性信息，但对于我们深入理解胎生苗形态建成的机理仍具有一定的局限性，下面将从相关基因调控方面来进一步阐述落地生根胎生苗的发育。
落地生根胎生苗的发育经历了类似器官发生和胚胎发生的过程，而植物的器官发生和胚胎发生的过程是基因有序的、选择性表达的结果。目前，在对落地生根胎生苗发育的研究中发现，与其形态建成相关的基因主要有SHOOT MERISTEMLESS(STM)基因、LEAFY COTYLEDON 1(LEC1)基因、FUSCA3(FUS3)基因和SAHH基因。其中，STM基因为胎生苗器官发生调节因子，而LEC1基因和FUS3基因为胚胎发生调节因子，它们共同参与胎生苗的发育过程。
2.1 STM基因KNOX(KNOTTED-like homeobox)基因编码具有同源异型盒结构域的蛋白，其中多数蛋白具有转录因子的功能，在植物发育中是重要的调节因子[19]。根据同源异构结构域的表达模式及序列的相似性，通常将KNOX基因分为KNOX1和KNOX2基因[20]。KNOX1(class one genes)基因对分生组织的形成和维持具有调控作用，并在叶片发育中起关键作用，主要包括STM基因，KNAT1、KNAT2和KNAT6基因[21]，玉米中的同源KNOX1基因[22]及水稻中的OSH1基因[23]等。其中STM基因是调控植物分生组织形成的重要基因，植物发育过程中参与胚芽分生组织的形成，在顶端分生组织的发育中，STM是最早表达的基因[21]。拟南芥中，STM基因功能缺失性突变导致植株无法形成顶端分生组织(SAM)并抑制植株幼苗期的发育[24]。转基因植株中KNOX1基因结构性过量表达可使叶片上形成异常的芽体[25-27]。KNOX1基因家族的单基因突变体叶片有明显的发育缺陷以及形态上出现较突出的变化[28]。
落地生根STM(KdSTM)蛋白与拟南芥STM蛋白有75.5%的同一性，且KdSTM和拟南芥STM均位于KNOX1基因第1级进化枝上。因此，KdSTM是STM的直系同源[15]。在落地生根胎生苗发育过程中对KdSTM mRNA进行定位检测，顶端分生组织和腋生芽中有高水平的KdSTM转录物[15]，这与大多数单子叶植物的STM表达模式一致[29]。胎生苗的发育起始于单个或几个细胞[14]，在叶缘这一小群细胞中同样检测到了KdSTM mRNA。在胎生苗发育到心形胚阶段，维管束和胎生苗上部类似子叶的叶片中KdSTM转录物的量增加[15]。而在拟南芥合子胚中，STM的表达仅局限于球形胚阶段的细胞中，在子叶原基中并未发现；在玉米体细胞胚发生中，KNOX1基因的表达范围比玉米合子胚中的更广[30, 31]。因此，KdSTM在胎生苗发育的全程中均有表达，这种表达模式与合子胚以及体细胞胚并不相同[30, 32]。Garcês等[15]用RNA干扰(RNAi)下调KdSTM RNA水平以确定其功能。多数转基因株系胎生苗的形成表现为完全抑制，在形成胎生苗的株系叶缘检测到KdSTM mRNA，说明KdSTM在此株系中为不完全抑制，这是由于顶端分生组织中花椰菜花叶病毒35s启动子活性降低将此区域与基因沉默效应隔离所致[33, 34]。因此，KdSTM在胎生苗发生的起始部位、器官发生和胚胎发生中均有表达，且多数KdSTM RNAi植株中胎生苗形成表现为完全抑制，充分说明胎生苗的形成需要KdSTM，其可能通过启动和/或维持叶片凹槽处未分化的细胞库起作用[15]。将KdSTM基因构建表达载体并转化烟草，发现转基因烟草的早期出现较小分枝的侧芽而野生型无侧芽出现[35]，进一步说明KdSTM基因对芽的再生具有一定的促进作用。
2.2 LEC1基因LEC1、LEC2和FUS3基因编码LEAFY COTYL-EDON(LEC)蛋白，是植物胚胎形态发生和成熟所需的胚胎调控基因。Meinke等[36]对拟南芥lec突变体lec1、lec2和fus3进行研究发现，该突变体存在显著的胚胎成熟缺陷。Lotan等[37]首次在拟南芥中分离出LEC1基因，并发现拟南芥LEC1基因在胚胎发生时期表达，在合子胚和体细胞胚中的表达模式相类似。继从拟南芥中克隆出LEC1基因后，先后分别在玉米[30]、胡萝卜[38]和向日葵[39]等植物中克隆得到LEC1基因，并且与拟南芥LEC1基因具有较高的同源性。LEC1基因编码CCAAT-box结合因子HAP3亚基的同源物，并可能以转录因子亚基的身份对胚胎发育相关基因的活性进行调控来调节胚胎发生[40]。研究表明，LEC1在转基因植物中的异位表达可在营养细胞中诱导体细胞胚和类似体细胞胚结构的形成[37]。LEC1的功能缺失性突变导致胚胎停止发育和因不能忍受干燥环境而无法存活[41]。说明LEC1基因在合子胚和体细胞胚发育过程中具有重要功能。
落地生根LEC1(KdLEC1)的同源序列与拟南芥LEC1型AHAP3蛋白保守B区的蛋白序列有72.2%的同一性。KdLEC1编码的氨基酸残基与LEC1型具有特异性。因此，KdLEC1为LEC1的直系同源。对该基因进行序列分析，显示KdLEC1基因的C末端区域B功能位点缺失20个核苷酸，导致其编码的蛋白增加11个特有的氨基酸，并在B功能位点提早出现终止密码子而形成截短的LEC1蛋白[15]。LEC1是控制胚形成和发育的关键调控因子。在拟南芥和其他植物中，只有在胚胎发生中能够检测到LEC1的表达，在营养生长中并未检测到。在落地生根合子胚的鱼雷胚阶段发现KdLEC1的转录物，而SAM中无法检测到，这与LEC1在拟南芥胚中的模式相似[37]，说明KdLEC1同样是落地生根胚胎发生的标志基因。对发育中的胎生苗进行检测分析得到KdLEC1 mRNA与KdSTM的模式相似，在胚的早期阶段和心形胚阶段均检测到KdLEC1 mRNA[15]。这些结果表明落地生根胎生苗发育过程中经历了类似器官发生和胚胎发生的阶段。
lec1突变导致胚变得不耐干燥，从而使种子无法萌发[41]。KdLEC1蛋白为拟南芥LEC1蛋白的截短形态，为探究KdLEC1能否阻止拟南芥lec1突变，转化不同版本的KdLEC1基因于WT拟南芥和lec1突变植株，结果显示只有当KdLEC1 B功能区域的删减核苷酸被相应的来自拟南芥LEC1-LIKE(L1L)基因的核苷酸所取代从而重建完整的B功能区域时，0.65%的lec1突变种子才产生可存活的幼苗，这个百分比与转化LEC1基因的WT拟南芥的百分比相似[15]。说明完整的B功能区域通过给予lec1突变种子干燥耐受力来阻止lec1突变，而KdLEC1的B区缺失20个核苷酸，无法阻止lec1突变。而L1L可以阻止lec1突变，因此二者在功能上是等效的[40]。研究表明LEC1型B结构域特有的氨基酸残基——Asp55是其调控胚胎发生的必要条件[42]。落地生根无法产生有生殖能力的干燥种子，可能是由于KdLEC1不能给予合子胚干燥耐受力[5]。
尽管KdLEC1基因B功能区域不完整，无法给予种子干燥耐受力和阻止lec1突变，为验证其在叶片胎生苗形成中是否有获得性附加功能，Garcês等[15]检测了在KdLEC1下调对胎生苗发育的影响，所有KdLEC1 RNAi植株在其叶缘形成了与未转化或转化空载体的对照植株相同水平的胎生苗，表明落地生根胎生苗的形成不需要KdLEC1基因。KdLEC1在拟南芥胚胎发生中无法呈现正常的LEC1基因功能，在胎生苗发育过程中KdLEC1 RNA的积累可能仅仅是胚胎发生环境中启动子响应的活化反映。
2.3 FUS3基因FUS3基因属LEC基因家族，编码B3功能区蛋白[43, 44]，为胚胎发生的标志基因。Luerssen等[44]发现FUS3基因在拟南芥胚胎发育早期表达，说明FUS3基因在植物胚胎发育中具有一定作用。潘丽娟等[45]对花生FUS3基因进行克隆和表达分析，推测其在花生的胚胎形成和发育中发挥重要作用。拟南芥fus3突变体在形态上与lec1突变体相似[46, 47]，表明两种蛋白调控共同的下游基因系列[48]。且有研究表明FUS3与LEC1在合子胚与体细胞胚中的表达模式相似[49]。Gaj等[50]对LEC1、LEC2和FUS3三个突变体中的体细胞胚发生情况进行分析，发现与野生型相比，3个基因的单突变体其胚胎发生频率显著降低，双突变体和三突变体的体细胞胚胎发生则完全被抑制，说明LEC/FUS基因在体细胞胚发生过程中起重要作用。
落地生根FUS3(KdFUS3)蛋白与拟南芥FUS3蛋白有64%的同一性，系统发生分析显示KdFUS3属于单系FUS3蛋白家族。定量(q)RT-PCR结果显示KdFUS3在落地生根的芽尖没有显著水平的表达，与KdLEC1类似，在授粉子房和叶缘发育的所有阶段均有高水平的表达，在胎生苗发育的最晚期阶段表达量达到最高。KdLEC1和KdFUS3这2个胚胎发生标志基因在胎生苗发育和授粉子房中高水平表达，而在顶端分生组织中不表达或低水平表达，说明在落地生根胎生苗发育过程中包含了与胚胎发育类似的过程[15]。然而，KdFUS3基因在胎生苗发育中的功能还不清楚，仍需进行深入研究。
2.4 SAHH基因S-腺苷高半胱氨基酸水解酶(S-adenosylhomocy-steine hydrolase，SAHH)是广泛存在于生物细胞内的一种酶，对S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomoc-ysteine，SAH)可逆水解为腺苷(adenosine，Ado)和高半胱氨酸(homocysteine)有一定的催化作用，参与细胞代谢中的甲基化作用。SAHH基因错位突变或进行RNAi实验，可导致SAHH功能部分缺失，植株表现为生长缓慢，生殖能力弱小或变弱[52, 52]。钟天秀等(Zhong)[53]从落地生根胎生苗差减文库中筛选出SAHH cDNA片段，Real-time PCR检测显示该基因片段在胎生苗样本中的表达量为无胎生苗的4倍。鉴于SAHH基因在胎生苗中的高表达量，推测其在胎生苗的发育过程中具有一定的作用，但其具体的功能还需进一步的研究予以确定。苏振声等[54]克隆了落地生根SAHH基因全长序列，运用生物信息学技术预测其编码蛋白的理化性质及空间结构，为研究落地生根胎生苗发育的分子机制提供了基因资源和研究方向。目前为止，SAHH基因在落地生根胎生苗发育过程中的功能还有待进一步的深入研究。
3 展望目前，对落地生根胎生苗的研究取得了一定的成果，胎生苗发育的形态学过程已经比较清楚，相关基因的研究也取得了一定进展。但是，胎生苗发育集合器官发生和胚胎发生，其具体的分子调控机制尚不明确，有必要进行深入的研究。KdSTM基因的作用机制，KdFUS3和SAHH基因在胎生苗发育中的功能仍是有待解决的问题。此外，更多相关基因的发现和探究也是有必要的。
近年来，对拟南芥的突变体进行研究得到，与植物分生组织的发生与维持有关的基因除STM基因外，还有KNOX1中的其他基因以及WUS(WU-SCHEL)、CLV3(CLAVATA3)和CLV1(CLAVATA1)等基因[55]。除LEC1基因和FUS3基因外还有许多基因调节着其胚胎发生，如LEC2、KNOLLE、AGL11、AGL15及SIN等基因[56]。这些与植物器官发生和胚胎发生有关的基因在落地生根中的表达情况和具体功能仍未有所研究，未来可在相关方面进行探讨和研究。随着分子生物学技术的不断发展与更新，以及科学界对落地生根胎生苗发育研究的不断深入，更多与胎生苗发育相关的基因将会被陆续发现和研究，并且不仅要揭示单个基因的表达与功能，还要对基因间的联系和配合进行一定的研究，从而进一步完善胎生苗发育的分子机制。
此外，在伽蓝菜属的一些物种中，胎生苗的形成受外界压力、植物激素等因素的影响。羽叶垂花树(K. pinnata)中，直到叶片脱落或用激动素处理叶片时才形成胎生苗[57]。Bryophyllum marnierianun中，叶片离开植株后在叶缘形成胎生苗，而与茎一同切除的叶片上不形成胎生苗。Kulla[58]检测了一些激素对Bryophyllum marnierianun离体叶片胎生苗形成的影响，其中生长素对其没有影响，而细胞分裂素中的玉米素、激动素和苄氨基嘌呤(BAP)强烈抑制胎生苗的发育，揭示细胞分裂素在叶片与植株连接时是使胎生苗原基保持休眠的因素。此外，生长素和乙烯对胎生苗根系的发育具有一定的影响，只有当来自胎生苗顶芽的生长素积累到某一临界值时根系才开始发育，乙烯则通过降低该临界值而使根系发育提早[59]。迄今为止，外界压力及植物激素等对落地生根胎生苗发育的影响尚不清楚，未来仍需在相关方面进行深入研究，以期探讨胎生苗发育的机理。
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