2. 天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384
2. College of Food Science and Biotechnology，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384
微生物多糖安全无毒、理化性质优良，在食品、医药、材料等许多工业领域具有广泛的应用价值，比动物多糖、植物多糖具有更为广泛的应用前景[1]。鞘氨醇胶是鞘氨醇单胞菌属菌株合成的一类微生物多糖的统称，其多糖主链结构相似，侧链基团种类多样[2]。韦兰胶是由Sphingomonas sp. ATCC 31555发酵产生的一种胞外多糖，是继黄原胶和结冷胶之后最具市场前景的微生物胶之一。韦兰胶的主链由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖的四糖重复单元组成，侧链由单链的L-甘露糖或单链的L-鼠李糖构成[3]。韦兰胶溶液具有独特的剪切稀释性能，以及增稠性、悬浮性和乳化性[4]，在石油开采、水泥及混凝土制品等领域具有广泛的应用，并具备在食品、医药等领域应用的潜力[5]。
目前韦兰胶的工业化生产仍存在一些问题，其碳源转化率仅有40%-50%、产量只有15-20 g/L，与黄原胶等微生物胶的发酵生产相比，韦兰胶的碳源转化率和产量都较低，生产成本较高[6]，为解决此问题，研究者在培养基和发酵调控方面进行了大量研究，使韦兰胶的发酵产量得到不同程度的提高[7, 8]。但韦兰胶合成菌原生质体制备与再生条件的研究还未见报道，本研究以韦兰胶合成菌Sphingo-monas sp. ATCC 31555为出发菌株，对影响菌株原生质体制备与再生的因素进行了研究，以期获得生产成本低及产量提高的目的菌株，为利用原生质体融合及基因组改组等选育更为优良的菌株提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株韦兰胶产生菌（Sphingomonas sp.）ATCC 31555。
1.1.2 试剂磷酸缓冲液：0.1 mol/L磷酸氢二钠，0.1 mol/L磷酸二氢钠 pH7.0;高渗缓冲液：0.1 mol/L磷酸氢二钠，0.1 mol/L磷酸二氢钠，0.8 mol/L甘露醇 pH7.0;原生质体稳定液（SMM）：0.5 mol/L蔗糖，20 mol/L MgCl2，0.02 mol/L顺丁烯二酸，pH6.5;溶菌酶：用SMM溶液配制，终浓度0.5 mg/mL，过滤除菌，-20℃保存备用。酚藏花红染色剂（Sigma）。
1.1.3 培养基固体培养基（g/L）：蔗糖15.0，蛋白胨5.0，牛肉膏3.0，酵母膏3.0，琼脂粉15.0，pH7.0。液体培养基（g/L）：蔗糖15.0，蛋白胨2.5，磷酸氢二钾2.5，磷酸氢二铵1.5，硫酸镁0.1，酵母粉1.5，pH7.0。补充基本培养基（BNK）（%）：蔗糖18.1，蛋白胨0.5，牛肉膏0.3，琼脂粉2.0，pH7.0。再生补充培养基（BZNK）（%）：BNK配方中琼脂改为0.8。
1.2 方法 1.2.1 菌种活化取-70℃保藏的菌种Sphingomonas sp. ATCC 31555，在无菌操作条件下将其划线到固体平板培养基上，30℃恒温培养72 h，挑取单菌落在试管斜面上蛇形划线，30℃恒温培养72 h。
1.2.2 菌株发酵曲线的测定在无菌操作条件下，用5 mL无菌水将试管斜面上的菌体冲洗下来，按10%的接种量将其接种到含有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，30℃，180 r/min摇床培养72 h，定时取样，并测定发酵液的pH、菌数、黏度和韦兰胶的产物量。
1.2.3 原生质体的制备菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555液体培养至对数生长前期，取适量菌液在8 000 r/min条件下离心5 min，弃上清液，用磷酸缓冲液洗涤菌体细胞。将菌体悬浮于适量的SMM缓冲液中，使溶液中细胞浓度约含108-109 CFU/mL。取菌液0.1 mL，用无菌水倍比稀释，涂布平板培养基，30℃培养4 d后得菌落数A（菌落总数）。在剩余的菌悬液中加入溶菌酶，混合均匀后于37℃保温一定时间，4 000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，取菌液0.1 mL，用无菌水倍比稀释，进行剩余菌数B（未被酶裂解的剩余细胞）的测定。
1.2.4 原生质体的再生取0.1 mL酶解后的原生质体悬液，用SMM缓冲液倍比稀释，取1 mL加入底层BNK补充培养基的中央，再倒入上层BZNK培养基，混匀，30℃培养4-5 d后计数，将菌落数计为C（再生菌落数）。原生质体形成率与再生率的计算公式：原生质体形成率（%）=（A-B）/A×100%，原生质体再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100%。
1.2.5 菌体与原生质体的荧光显微镜观察用SMM溶液作溶剂配制0.01%的酚藏花红染色剂[9]。将菌悬液和制备好的原生质体溶液分别与酚藏花红染色剂按1∶1的比例进行染色，然后取少量滴于载玻片上，加盖玻片，在荧光显微镜下进行观察。
2 结果 2.1 菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555的发酵曲线对菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555进行72 h的摇瓶发酵，其间进行pH、黏度、菌数和韦兰胶产物量的测定。细胞生长曲线（图 1）显示，菌株在培养5 h后进入对数生长期，58 h进入稳定期，此时菌数达9.5×109 CFU/mL;韦兰胶产物量曲线与细胞生长曲线近乎平行，在58 h时达到韦兰胶产量最高;发酵液的pH在6-7之间小范围波动，因韦兰胶属于酸性多糖，且使用高碳氮比培养基，发酵期间pH总体呈降低趋势，发酵67 h时pH最低为6.31;发酵液的黏度在对数生长期的后期迅速增加，在67 h达到最大值。由于菌株合成产物后，细胞外包裹高分子多糖不利于原生质体的制备，选择黏度较低的10 h菌龄发酵液进行原生质体制备的研究。
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| 图 1 菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555 的发酵曲线 |
本研究对不同浓度梯度的EDTA对菌体进行预处理，结果（图 2）显示，原生质体的形成率随着EDTA浓度的增大而增大，再生率则在12 mmol/L之前呈上升趋势，之后呈下降趋势。随着EDTA浓度的增大，菌体细胞壁的破坏程度越来越大，酶的作用增强，形成率和再生率上升，再生率在EDTA浓度为12 mmol/L之后下降。以原生质体形成率与再生率乘积作为判别标准[10]，选择EDTA浓度为12 mmol/L作为原生质体制备与再生的最佳浓度。
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| 图 2 EDTA 浓度对原生质体形成率与再生率的影响 |
本实验在菌体培养10 h时，加入0-100 μg/mL浓度梯度的青霉素继续培养2 h后，加入EDTA预处理和溶菌酶进行作用，观察青霉素预处理对原生质体制备与再生的影响，结果如图 3所示。菌株原生质体的形成率呈下降趋势，青霉素对再生率的影响比较明显，在青霉素浓度为10 μg/mL之后，原生质体再生率急剧下降，原因是随着青霉素浓度的增大，抑制了菌体的正常生长，细胞数量下降，再加上酶对原生质体的伤害，使得原生质体的形成率和和再生率都降低。综合考虑原生质体的形成率与再生率，选择不加青霉素作为菌株原生质体制备与再生的最佳条件。
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| 图 3 青霉素浓度对原生质体形成率与再生率的影响 |
对5-245 µg/mL之间浓度梯度的溶菌酶进行实验，结果（图 4）显示，随着酶浓度的增加，原生质体形成率逐渐增大，再生率在酶浓度为45 µg/mL时值最大，为31.1%，之后迅速下降。依据原生质体形成率与再生率乘积最大原则[10]，选择酶浓度为45 µg/mL作为原生质体制备与再生的最佳条件。
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| 图 4 酶浓度对原生质体形成率与再生率的影响 |
本研究在不同的酶解温度下进行了原生质体制备与再生实验[11]，结果如图 5所示。随着温度的升高，原生质体的形成率一直上升，原因是随着温度的升高，酶的活性增强。再生率则相反，呈下降趋势，一方面是因为酶在作用过程中，不仅酶解了细胞壁，还对早期形成的原生质体膜造成了损伤，另一方面是因为菌体的最适培养温度为30℃，温度升高使原生质体的活性降低，导致其破坏甚至死亡，因而再生率较低[12]。综合考虑，选择酶解温度为28℃作为原生质体制备与再生的最佳条件。
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| 图 5 酶解温度对原生质体形成率与再生率的影响 |
对不同的酶解时间进行研究，结果（图 6）显示，酶解时间在25 min之前，原生质体的形成率上升较快，之后增长缓慢，再生率则一直处于下降趋势。原因是随着酶解时间的延长，在25 min时原生质体基本释放完全，再延长酶解时间，原生质体形成率也不会大幅度增加。由于酶解时间过长，细胞脱壁太彻底，使细胞失去再生的引物，且杂酶的损害程度也增强[13]，因而再生率下降。综合考虑，选择酶解时间为25 min作为原生质体制备与再生的最佳条件。
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| 图 6 酶解时间对原生质体形成率与再生率的影响 |
在最佳条件下，菌体培养至对数生长前期10 h，12 mmol/L EDTA预处理，溶菌酶浓度45 μg/mL，酶解温度28℃，酶解时间25 min的条件下进行实验。结果表明，原生质体形成率达97.3%，再生率达33.9%。菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555及其原生质体经酚藏花红染色后，在荧光显微镜下的细胞形态。由图 7可以看出菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555的细胞为杆状，两端略窄，大小为（0.5-0.7）μm×（1.0-1.7）μm。其原生质体大多数菌体呈类球状，直径0.6-0.9 μm，实现了原生质的制备。
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| 图 7 韦兰胶合成菌的细胞（A）及其原生质体（B）形态 （1 000×） |
本研究用酶法去除菌株细胞壁制备原生质体，在原生质体的形成与再生过程中，要获得较高的原生质体形成率与再生率，应综合考虑各个影响因素[14]。微生物的生理状态对原生质体的形成非常重要，对数生长期的细胞生长比较旺盛，活力较强，酶解易于释放原生质体[15]，但随着培养时间的延长，胞外多糖产物会阻挡酶对实验菌株的作用，因此选择对数生长期初期作为原生质体制备的最佳菌龄。原生质体制备时，溶菌酶作用于细胞壁肽聚糖主链的β-1，4-糖苷键上，从而破坏细菌的细胞壁结构[16]，但革兰氏阴性菌的原生质体制备更为复杂，阴性菌细胞壁的肽聚糖结构外还有脂多糖层，会阻挡溶菌酶的作用，EDTA可以螯合Ca2+和Mg2+，使脂多糖解体，进而暴露内层的肽聚糖分子被溶菌酶所水解[17]，结果显示EDTA有利于对实验菌株的酶解。青霉素可以与转肽酶的活性中心结合，抑制肽桥的形成，从而抑制细菌细胞壁中肽聚糖的交联，使细胞壁结构疏松，有利于溶菌酶的作用[18]，但本实验的结果显示青霉素影响菌株生长，降低了原生质体形成率，因此不选择使用青霉素进行预处理。不同的微生物菌种细胞壁组分有差异，因而对酶的敏感性不同，不同厂家溶菌酶的活性差异以及实验菌株的生长温度范围，都会影响酶促反应的条件，如酶浓度、酶解温度及时间等，进而影响原生质体的形成率与再生率，因此，有必要对酶促反应条件进行研究。原生质体制备时，随着溶菌酶浓度的增加，酶与菌体的作用更加充分，所以原生质体形成率上升，但过高的酶浓度，使溶菌酶中混有的杂酶（核糖核酸酶、过氧化物酶等）作用呈现，造成原生质体的活力降低[19]。酶解时间过短，原生质体释放不充分;酶解时间过长，会使形成的原生质体皱缩，且损害细胞质膜或造成原生质体破裂，导致再生率下降[20]。
4 结论本研究通过对影响韦兰胶合成菌Sphingomonas sp. ATCC 31555原生质体制备与再生的最佳条件：菌龄10 h，12 mmol/L EDTA预处理，溶菌酶浓度45 µg/mL、酶解温度28℃、酶解时间25 min，在此条件下菌株原生质体的形成率和再生率分别达到97.3%和33.9%。
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