油茶（Camellia oleifera Abel）主要是指山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia L.）植物中油脂含量较高且具有栽培经济价值的一类植物的总称^[1]，是原产于我国的食用木本油料树种。袁嗣令等^[2]发现油茶炭疽病可以引起油茶落花、落果，给茶农带来极其严重的损失。近几十年来，国内植物病害学者对油茶炭疽病做了大量的研究，普遍认为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）是引起油茶炭疽病的病原菌^[3-12]。但是，随着多基因序列鉴定病原菌方法的引入，可将形态学上很难区分的新种鉴定并从复合种中分离出来，大大提高了对炭疽属真菌鉴定的准确率。例如，张海英等^[13-16]通过形态学观察及单基因序列分析，将中国草莓炭疽病的主要病原物鉴定为胶孢炭疽菌，而韩永超等^[17]通过ACT、TUB2和CAL三个基因系统发育分析，将武汉地区草莓根颈腐烂病的病原鉴定为胶孢炭疽菌复合种内的C. siamense^[18]；杨友联等^[19]采用多基因谱系方法将胶孢炭疽菌复合种划分成22个种和1个亚种；杨友联结合形态学及多基因系统学，将采自中国贵州、云南、广西等省的190株炭疽菌属菌株确定为22个分类单元。李河等^[20-22]利用形态学观察及多基因分析方法，发现油茶炭疽病的病原除了胶孢炭疽菌外，还有果生刺盘孢菌（Colletotrichum fructicola）、暹罗刺盘孢菌（Colletotrichum siamense）及博宁炭疽菌（Colletotrichum boninense）。因此，有必要对油茶炭疽病致病菌进行进一步的研究，另外，油茶炭疽病菌对不同品种油茶致病性的研究在国内也鲜见报道。我们从湖南、江西及海南油茶产区采集病叶，对病原菌进行分离纯化，通过形态学观察并结合多基因序列分析方法，发现炭疽属的山茶刺盘孢（C. camelliae）也可以使油茶致病，并进行该菌对湘林1号、湘林69号、湘林89号、赣无1、赣无16、广西红花、长林3号、长林4号、长林23号、长林53号、长林148号、长林190号等12个品种油茶致病性的测定，旨在为防治该病菌引起的病害提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品来源

于2014年10月从湖南浏阳市、江西长埠镇及官山林场采集典型油茶炭疽病病叶，2015年4月从海南澄迈林场采集典型油茶炭疽病病叶。

1.1.2 培养基^[23]

PDA培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。SNA培养基：磷酸二氢钾1.0 g，硝酸钾1.0 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，葡萄糖0.2 g，蔗糖0.2 g，琼脂14 g，蒸馏水1 000 mL。

1.1.3 试剂

DNA快速提取试剂盒Fast DNA Kit，美国MPBIO公司；2×Taq PCRMaster Mix，天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 仪器

ABI 9700 PCR仪，美国应用生物系统公司；快速核酸提取仪，美国MPBIO公司；5145D离心机，德国Eppendoff公司；Nikon 80I显微镜，NIKON仪器（上海）有限公司。

1.2 方法 1.2.1 病原菌分离及纯化

采用常规组织分离方法^[23]进行病原菌分离和纯化。分离得到的菌株于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 病原菌生物学鉴定

将菌株接种在PDA及SNA平板上，28℃恒温培养10 d，每天观察记录菌落形态，并测量菌落直径。光学显微镜下观察分生孢子和附着孢形态，并测量分生孢子大小。

1.2.3 病原菌DNA的提取、扩增及核苷酸序列测定

将纯化好的菌株接种至PDA平板，28℃培养7 d，用无菌牙签刮取适量菌丝放入1.5 mL离心管中，采用夏花等^[24]的实验方法进行病原菌DNA的提取。基因选择及目的片段扩增与测序参照Weir等^[18]的方法、反应体系及条件，实验所用引物及相关内容见表 1。PCR产物委托上海铂尚生物技术有限公司测序。

1.2.4 菌株多基因系统发育树构建

使用ClustalW软件对测序获得的3个基因分别进行比对和手工校正，然后按照ITS-CAL-GAPDH的顺序分别首尾相连，并下载GenBank中同时含有上述3个基因序列的炭疽属菌株的序列，按照ITS-CAL-GAPDH的顺序首尾相连后进行同源性分析，用软件MEGA6.0构建N-J系统发育树。

1.2.5 致病性测定

选用湖南省种植广泛的油茶品种“湘林1号”进行病原菌的致病性测定。用无菌牙签蘸取分离到的5个菌株（编号见表 2）的分生孢子悬浮液（105个/mL）后刺扎油茶叶，CK组用无菌水处理，置于室外套袋保湿培养，每个菌株接种30个叶片，CK组处理30个叶片。每天观察叶片发病情况。对发病叶片再进行病原菌分离及与接种病原菌进行形态特征比较。

1.2.6 病原菌对不同品种油茶致病性测定

为了明确分离到的病原菌对不同品种油茶的致病性，对湘林1号、湘林69号、湘林89号、赣无1、赣无16、广西红花、长林3号、长林4号、长林23号、长林53号、长林148号、长林190号等12个品种（两年生）叶片进行活体接种。接种方法同1.2.5。

2 结果 2.1 病原菌分离及形态学鉴定

从湖南、江西及海南三省油茶产区分离到5株形态特征疑似炭疽病原菌的菌株（编号分别为HNLY6-2、HNLY6-3、JXGS-B8、JXCB21、CMHN-YC15），5个菌株在PDA培养基上形态特征相似（图 1），培养7 d时，菌落直径约为6.5 cm，生长速率约为9.3 mm/d；菌落近似圆形，气生菌丝稀疏，紧贴培养基，初期为白色，培养7 d后菌落中央由白色渐变为灰白色，菌落边缘仍为白色；培养10 d时，黑色素大量沉积，致使整个培养皿背面变为黑色。在SNA培养基上，分生孢子无色、光滑，单孢，长椭圆形或圆柱形，两端圆或一端略粗，另一端稍尖，大小为（13±3.5）μm×（3±2）μm；附着孢从菌丝上产生，末端膨大，呈不规则形状，颜色较深（图 1）。

2.2 致病性测定

经致病性测定发现，在接种3-4 d后，病原菌可使油茶叶片表现发病症状，病斑初期呈褐色不规则斑块，并逐渐扩展，渐变为深褐色或黑色，后期病斑呈灰色，病斑直径5-18 mm（图 2-A）。经进一步病原菌分离，获得与接种菌株一致的分离物，表明分离到的菌株为油茶炭疽病的病原菌。

2.3 菌株多基因系统发育分析

5个菌株的编号及每个基因的GenBank登录号见表 2，5个菌株的ITS-CAL-GAPDH序列与GenBank下载的菌株序列的聚类分析结果（图 3）显示，5个分离菌株与2株C. camelliae聚为一支，自展支持率为95％，能够与炭疽属其他种区分开；其它分支中，炭疽菌属同种菌株也都以非常高的支持率聚为一个进化枝。结合菌株形态特征及多基因系统发育分析，可将分离到的5株病原菌鉴定为山茶刺盘孢C. camelliae。

2.4 病原菌对不同品种油茶致病性测定

不同品种油茶叶片接种实验（表 3）表明，C. camelliae均可侵染湘林1号、湘林69号、湘林89号、赣无1、赣无16、广西红花、长林3号、长林4号、长林23号、长林53号、长林148号、长林190号等品种。其中，湘林1号、湘林69号、湘林89号、广西红花、长林3号、长林4号、长林23号、长林53号、长林148号及长林190号等品种上的症状类似（图 2）；广西红花、赣无1、赣无16品种叶片上形成的病斑不易扩展，且10 d后病斑明显比其他品种小。连续观察发现病菌在不同品种叶片上出现症状的时间（3-10 d）不同（表 3）。

3 讨论

炭疽属真菌危害全球多种植物，如谷物、蔬菜、水果等，给农民造成了严重的经济损失。炭疽属真菌早期主要依据形态特征进行鉴定，可用于鉴定的指标有分生孢子、附着孢的形状及大小，以及刚毛、分生孢子梗和产孢细胞大小，菌核、后垣孢子的有无及形态等。Von Arx^[25]根据分生孢子的大小来界定种，将750多个种合并为11个种，使得一些种成为复合种或种群（Species group）；Damm等^[26]将分生孢子梗实际应用于分类中，结合其它形态特征，很好地界定了草生弯孢类该属真菌，引进了6个新的分类单元。20世纪90年代之后，随着分子生物技术的发展，ITS序列在该属真菌分子系统学研究中得到广泛应用，为很多物种的鉴定和系统进化分析提供了有利的工具。例如，C. boninense最初基于形态特征被鉴定为C. gloeosporioides，而Moriwaki等^[27]利用ITS序列进行系统分析，将其独立为新的分类单元。然而Avise等^[28]指出仅仅依靠ITS序列不能有效地进行种的识别，否则会导致错误的结论。此外，Crouch^[29]也指出在GenBank所登录的序列中，约有86%的炭疽属真菌的ITS序列被错误定义。Cai等^[30]提出采用多基因序列分析来对炭疽菌进行分子鉴定，这在一定程度上提高了对炭疽属真菌的鉴定准确率。例如，Crouch^[31]运用ITS、Apn2、Mat1/Apn1和Sod2四个基因进行联合分析，对形态上极难识别的集合种C. gramincola区分开来，恢复C. cereale和C. eleusinsines为合格种，并引入了6个新种；Damm等^[26]利用ITS、ACT、TUB2、CHSI、HIS3和GAPDH六个基因序列进行分析，将草本植物上的黑线炭疽菌区分开来，并引入了4个新种。

目前已报道能侵染油茶的炭疽病原有胶孢炭疽菌C. gloeosporioides、果生刺盘孢菌C. fructicola、暹罗刺盘孢菌C. siamense及博宁炭疽菌C. boninense。本研究从湖南、江西及海南3个省市油茶发病叶上分离到5株菌落形态特征一致的菌株，但与上述菌相比，在菌落颜色上，C. gloeosporioides、C. fructicola和C. siamense呈浅灰色至深灰色，C. boninense呈奶白色至橘红色，而分离到的5株菌株菌落初期呈雪白色，7 d时菌落背面出现黑色素沉积，10 d后菌落渐变为灰白色，整个菌落背面呈黑色；报道的油茶炭疽菌的分生孢子堆颜色都为橘黄色，分生孢子形态椭圆形或圆柱状、单胞、无色，菌丝附着孢椭圆形或不规则形，褐色，然而本研究分离的5株菌株在PDA上较难培养出分生孢子及附着孢，在SNA上，分生孢子长椭圆形或圆柱形，两端圆或一端略粗，另一端稍尖，附着孢形状不规则，颜色较深。通过形态学观察及多基因序列分析，将本研究分离到的5株菌株鉴定为山茶刺盘孢C. camelliae。

本研究分离鉴定了一个新的油茶炭疽病病原——C. camelliae，通过研究C. camelliae对不同品种油茶致病性测定，发现C. camelliae对湘林1号、湘林69号、湘林89号、赣无1、赣无16、广西红花、长林3号、长林4号、长林23号、长林53号、长林148号、长林190号等品种的叶片致病，但出现病斑的时间不同，这可能与油茶品种的抗病性有关。目前国内有关不同油茶品种对炭疽病抗性的研究报道较多，杨光道^[32]通过林间调查及室内实验，发现攸县油茶、徽州大红、徽州小红、舒城大红4个品种为抗炭疽病品种，并对不同油茶品种抗炭疽病机制进行了初步研究；匡蓉琳等^[33]对14个油茶品种进行炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）接种实验，发现广宁红花油茶、腾冲红花油茶最为抗病，同时发现不同油茶品种的抗病性与油茶的净光合速率、气孔导度等生理指标相关；杨华等^[34]对广东省栽培的不同油茶种和品种进行林间调查及室内测定，发现广宁红花油茶属于抗病种类。下一步将从形态结构、生理生化、分子生物学及抗性基因角度研究C. camelliae与不同品种油茶的互作机制，通过研究油茶品种与炭疽菌之间的关系，获得抗炭疽病优良品种，可为推进油茶产业的健康、快速发展提供重要的指导。

4 结论

本研究分离纯化得到5株可引起油茶炭疽病的致病菌，利用形态学观察及多基因序列分析，将其鉴定为山茶刺盘孢（Colletotrichum camelliae）。同时进行病原对不同油茶品种致病性测定，发现可使湘林1号、湘林69号、湘林89号、赣无1、赣无16、广西红花、长林3号、长林4号、长林23号、长林53号、长林148号、长林190号等12个品种的叶片致病，且在不同品种油茶叶片上出现症状的时间不同。