2. 徐州绿健乳业有限责任公司，徐州 221006;
3. 甘肃省兰州大学第二医院遗传学研究室，兰州 730030
2. Xuzhou Lüjian Dairy Co.，Ltd，Xuzhou 221006;
3. Laboratory of Medical Genetics，the Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730030
随着基因组学、蛋白组学、代谢组学及生物大数据等研究的兴起和深入，生物海量数据获取对常规分析技术提出了挑战，高通量分析（high throughput screening，HTS）是指同时对一个样品中的多个指标，或者对多个样品中的一个指标同步进行并行分析，以在最短的时间内获得最多的生物信息的新型分析技术。与传统分析方法相比，HTS具有高通量、并行性、微量化、自动化等优点。按照检测原理分析靶标的不同，HTS主要包括生物芯片、焦磷酸测序技术、荧光偏振免疫分析技术等，可用于食品安全检测、医学诊断、药物筛选、植物育种、环境监测、司法鉴定等领域。本文综合国内外HTS最新研究进展，对HTS技术及应用予以分析和评述。
1 HTS技术及研究进展 1.1 微阵列芯片微阵列芯片主要包括基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片。主要由基片、基片固着物、结果报告系统、芯片扫描及分析软件4部分组成。基片材料主要有玻璃片、硅片、金属片、塑料、凝胶、尼龙膜和微孔板等；基片固着物包括核酸探针或捕捉抗体；结果报告系统包括经过荧光或酶标记的核酸或抗体；芯片扫描仪及分析软件是针对不同的生物芯片设计的对结果进行读取和分析的专用设备和软件。
1.1.1 生物芯片基片不同的基片材料会影响核酸或蛋白质的结合能力、芯片的背景值、样点均一性、信号强度等，近年来基片表面改性和新型基片材料的研发成为芯片研究的一大热点。玻璃片和硅片是使用最普遍的固相载体，但成本高、制作过程复杂、易碎。为了克服这些问题，Zhao等[1]研发出了用纸质材料作为基片的生物芯片，然而纸质生物芯片表面容易改性，通量低。尼龙膜、硝酸纤维素膜等主要利用吸附作用来连接蛋白质，对保持相对自由的蛋白质的活性有一定的优势，但容易造成非特异性吸附和蛋白质的变性[2]。凝胶是一种具有三维网络结构的聚合物，具有良好的吸水性和生物相容性，能够很好地保持蛋白质的活性，水凝胶蛋白芯片已成功运用于肿瘤标记物的检测和体外过敏诊断[3, 4]。透明塑料由于其成本低、透明度高、柔韧性好、易于加工等优点适合用于制作芯片，Jing等[5]研发了一种新型的用PC作为基片的芯片，具有低成本、制作简单、灵敏度高及可视化的特点。开发出低成本、制作简单、背景值低、结合性能稳定及能保持结合物活性的材料是未来芯片材料研究的重点。
1.1.2 芯片质控系统微阵列芯片是将大量探针分子整齐排列于固相载体上，然后与标记的样品分子进行杂交反应获取检测信息，探针在固相载体上的固定是芯片制作的关键步骤。目前，在芯片点样过程中所用的缓冲液多为无色的碳酸盐或磷酸盐缓冲液，使得芯片在点样后仍成无色状态，无法在芯片使用前对样点大小、样点均一性、甚至是否有样点进行预判。为了解决这一问题，有人在基因芯片的制作过程中对固定在芯片上的核酸进行荧光标记，不仅可对样点进行预判，而且可以对固定的核酸进行准确的定量[6, 7]。Delehanty等[8]将此方法用于蛋白芯片，但是由于蛋白质的结构比核酸复杂，此方法不仅加大了芯片的制作成本（需要用到芯片荧光扫描仪），而且荧光染料容易破坏蛋白质的空间结构。生物染色剂通常不会破坏蛋白质的空间结构且对核酸、蛋白质等染色效果好，Desmet等[9]用1 mg/mL溴酚蓝进行样点质量控制，Qiu等[10]将丽春红直接加入到蛋白芯片的点样缓冲液中并对丽春红的点样浓度进行了优化，实现了在芯片使用前对样点的圆润均匀程度进行预判。用直观简单的方法实现对芯片的质量控制对提高芯片检测结果的可靠性和稳定性意义重大。
1.1.3 芯片结果报告系统芯片的检测方法可分为两种类型：依赖于各种标记的间接法和直接非标记法。对于间接法，标记物的选择对检测结果的灵敏度有很大影响，常用的标记物有酶、荧光染料、功能性磁珠、纳米颗粒、生物素和胶体金等。Mavrogiannopoulou等[11]用链霉亲和素/生物素标记寡核苷酸来提高基因芯片的检测灵敏度，结果显示杂交信号增强了至少5倍，不仅灵敏度提高而且可以缩短PCR所需时间，加快了检测效率。Kim等[12]用金纳米颗粒标记目标DNA，用场发射扫描电子显微镜成像和计算纳米颗粒，纳米粒子标记的检测灵敏度可达到1 pM，是荧光标记的1 000倍。制作成本高、操作复杂是制约芯片发展的一个重要原因，李浩林等[13]采用可视化抗体宏阵列、酶标抗体化学显色等技术制作蛋白芯片，使检测结果肉眼可见，不需要借助昂贵的仪器，大大降低了芯片制作成本，但是此方法检测致病菌检测限仅为105，检测灵敏度还需要进一步提高。对于直接法，即用物理传感器记录传感器表面由分析物所引起的临近介质的某些物理特性（如电压、折射率和质量等）的变化，主要有表面等离子共振法、电化学分析方法和质谱分析方法等。
1.2 微流控芯片微流控芯片[14, 15]是在微流路系统中处理微量液体（10-9-10-18L）的技术，用极少量的样品和试剂就可完成检测，已广泛用于生物医学领域中，尤其适合在遭受自然灾害和资源缺乏的国家或地区进行快速检测，主要包括PCR芯片、流式芯片、毛细管电泳芯片、微电子芯片、色谱芯片及各类样品制备芯片等。微流控芯片在生物医学中的应用主要包括3个部分：细胞、核酸和蛋白质。相比于传统的检测方法，微流控芯片的优点有[16]：（1） 只需要微量的样品和试剂，极大降低了检测成本；（2） 在微流控系统中流体始终保持层流，能够准确控制微流控系统中的流速、压力和温度等流动变量；（3） 微流控系统比表面积大，能够在低浓度样品中快速检测出细胞、核酸或蛋白，这对于疾病的早期诊断非常重要。
用于制作微流控芯片的传统材料有硅、玻璃和石英等，主要采用刻蚀加工。高分子聚合物由于成本低、易于加工、具有良好的生物相容性等优点正日益成为微流控芯片的主要材料。目前，已有多种高分子聚合物材料被用于芯片制作，如聚酰胺（PA）、聚碳酸酯（PC）、聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT）、聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚甲基苯烯酸甲酯（PMMA）等。COC（环烯烃类共聚物）具有与PMMA相匹敌的光学性能以及具有高于PC的耐热性，低吸湿性和良好的化学稳定性，因而COC在微流控芯片领域有很好的应用前景，Roy等[17]证明用 N-乙烯吡咯烷酮单体进行改性的COC表面具有很高的粘结强度、表面湿润度和透明度以及很好的生物相容性。用聚合物材料制作微流控芯片常用的方法主要有热压成型法和注塑成型法，与热压成型相比，注塑成型能够降低生产成本，提高芯片生产效率，适合大批量生产[18]。宋满仓等[19]采用UV-LIGA技术制作成型微通道的型芯，设计制造了微流控芯片注塑模具并研究了各工艺参数对微通道复制度的影响，研究表明模具温度是主要影响因素，注射速度和熔体温度次之，由此形成的注塑工艺，对于宽80 μm、深50 μm 截面的微通道而言，可使微通道复制度由70%提高到90%。Matteucci等[20]用硅干法刻蚀、电镀法和注塑成型相结合制作微流控芯片并对制作工艺进行了优化，此方法制作的芯片能够很好地用于细胞捕获和DNA延伸。微流控芯片已突破其在加工制作技术上的难关，以微流控芯片为核心的微全分析系统将有望取代很多生物化学实验设备，走进实验室和生活中。
1.3 焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术是基于合成测序的一种新的DNA测序方法，这种实时荧光DNA测序技术是采用四种酶（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）的酶联级联化学发光反应，该技术已被证明适合用来进行单核苷酸多态性分析和DNA短序列的测序[21]。焦磷酸测序技术不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何形式的标记或染色，具有高通量、低成本、直观、高效的特点。可以应用于单核苷酸多态性（SNP）分析、突变检测、病原微生物快速检测、法医鉴定等。
虽然焦磷酸测序技术有上述很多优点，但要提高信号的强度，确保测序的准确性，还需要进行进一步的研究。如PCR参数的变化、测序引物的设计、样品的制备、核苷酸的配比等。测序中引物设计的不合理会导致测序信号值过低或者非特异性背景值过高，最终导致测序失败。叶卉等[22]系统研究了焦磷酸测序中引物的设计方法，得出提高PCR引物的多聚酶亲和指数有利于增强扩增效率与测序结果的信号峰强度，测序方向和dNTP 推注顺序的不合理选择会严重干扰部分SNP测序结果的判断。Groth等[23]用载体连接和生物素标记的方法制备焦磷酸测序单链DNA模板，单链DNA模板比双链DNA模板用于焦磷酸测序效果更好。随着对PCR参数的优化，对测序引物的改进以及对其他条件的改善，焦磷酸测序将有更高的灵敏度和特异性。
1.4 荧光偏振免疫分析技术荧光偏振免疫分析技术（FPIA）是一种竞争性免疫分析方法，利用荧光素经单一波长的偏振光照射后能吸收光能并发出相应的偏振荧光，偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关。待测物中抗原浓度高时，荧光标记抗原与抗体结合少，多呈游离状态，分子小，荧光偏振程度低；反之，当待测物中抗原浓度低时，荧光标记抗原多与抗体结合，分子大，荧光偏振程度高[24]。
荧光偏振免疫分析技术具有操作简便，快速，自动化，准确性好，灵敏度高，高通量的优点，只需将样品、抗体和示踪剂3种试剂混合后孵育几分钟甚至几秒钟就可以得到检测结果。Sheng等[25]用FPIA进行黄曲霉毒素的检测，研究显示完成微孔板上96种样品的检测总时间不超过5 min。无需将荧光标记物与非标记样品进行分离是FPIA的优点之一，但是为了避免灵敏度的降低，需要一种快速、简单的纯化方法有效去除试剂中影响检测灵敏度的杂质，Beloglazova等[26]研究了一种用FPIA检测啤酒中黄曲霉毒素B1的方法并采用氨基修饰硅胶吸附剂固相萃取法对检测样品进行纯化，该纯化方法简便、快速，有效去除了样品中的杂质，保证了检测灵敏度。
1.5 量子点荧光免疫分析技术作为一种发光半导体纳米晶体，与传统的有机荧光染料相比，量子点具有优越的光学性能，宽且连续的吸收光谱，较大的斯托克位移和狭窄对称的荧光发射光谱，因而被广泛用作荧光免疫分析的标记物用于致病菌，蛋白质和小分子物质的检测，可以显著提高检测灵敏度和分辨率，在高通量免疫分析中具有重要作用。Zhu等[27]用一种基于双色量子点和酶的免疫分析技术同时检测牛奶中的多种化学物质，但是只实现定量检测，Song等[28]用量子点荧光免疫分析方法进行牛奶中链霉素、四环素、青霉素的同时定性和定量检测，检测限达到5 pg/mL。
提高量子点的发光强度和抗体的稳定性是量子点荧光免疫分析方法的研究重点之一，王洪江等[29]以巯基乙酸为稳定剂，采用水相合成方法制备了CdS量子点，成功将单增李斯特菌抗体与CdS偶联，偶联后的IgG-CdS荧光强度为偶联前的4倍。杨淑平等[30]研究发现谷胱甘肽稳定剂优于巯基乙酸，由于其碳链较长，减少了量子点对抗体尤其是活性位点处空间构型的影响，大大提高了抗体的稳定性，与CdTe量子点相比，谷胱甘肽修饰的CdTe/Cds量子点荧光强度和稳定性分别提高6倍和2倍以上。
1.6 多重PCR多重PCR就是在同一PCR反应体系中加入两对或两对以上的引物，同时对多个模板或同一个模板的不同区域进行扩增的PCR技术。其反应原理、反应试剂和操作过程与普通PCR相同。近年来，多重PCR广泛应用于动植物病原检测、食品安全性检测、疾病诊断等领域中。多重PCR虽然具有简便、快速、经济、高效的特点，但目前也还存在一些问题，如反应灵敏度低、某一特定片段的优先扩增、容易形成引物二聚体等[31]。这些问题需要通过不断优化反应体系和反应条件来解决。
在建立多重PCR体系时，多重PCR引物的设计是非常关键的，决定了多重PCR的成败。主要需要考虑以下几方面：（1） 引物对之间是否有相近的Tm值，相近的Tm值能够保证在同一退火温度下实现对所有目的片段的同时扩增；（2） 是否会形成引物二聚体，引物二聚体的形成原因主要有体系中引物过多、体系中模板的量太少、引物设计过程中的误差等；（3） 引物之间的配比和浓度，一般多重PCR中每对引物的浓度都应该低于单一引物PCR中的浓度；（4） 各个扩增产物的长度，扩增产物的长度应该有适当地区别，以便在电泳图谱上能够清楚地区分出各个目的条带；（5） 各个引物对的特异性。Liu等[32]在设计多重PCR引物时，设计的所有引物有相似的退火温度（59-61℃），并对各个引物进行仔细分析，避免形成引物二聚体，实现了对造成烟草丛顶病的4种常见病毒的同时检测。
在优化PCR反应条件时，建议重点优化退火温度和延伸时间。退火温度通常是根据解链温度设定的，单一引物PCR中退火温度为56-60℃时适合特异性扩增，但多重PCR中温度降低4-6℃更适于所有目的片段的扩增[33]。Zong等[34]用多重逆转录PCR同时检测甜樱桃中常见的4种病毒（PNRSV、PDV、LChV-2和CGRMV），在对反应条件进行优化时，用梯度PCR的方法摸索最佳退火温度，结果显示退火温度为47-50℃时4个目的片段的基因扩增效果最好。延伸时间需要根据模板核酸的长度决定，多重PCR的延伸时间比普通PCR延伸时间稍长，扩增效果会更好[35]。
2 HTS的应用 2.1 在食品安全检测方面的应用食品安全问题与每个人的生活息息相关，但近年来食品安全问题日益凸出，为了保证食品的健康与安全，食品检测技术急需向着快速、简便、高通量的方向发展。食品检测主要包括食源性致病菌的检测、转基因食品的检测、食物中农兽药残留物的检测等。高通量检测技术的发展为食品检测提供了很多高效的检测方法。
在食源性致病菌的检测方面，许多研究者用各种HTS对食源性致病菌的检测进行了研究，在提高其检测通量、降低其检测成本的同时，提高了检测的灵敏度和准确性。现将部分检测结果归纳，如表 1所示。
在转基因食品的检测方面，Zhou等[42]用多重PCR与基因芯片相结合的方法检测草甘膦转基因大豆，当转基因作物含量为0.5%时仍可以检验出来，具有很高的灵敏度和准确性。赵胤泽和汪琳等[43]设计了能同时检测3种转基因成分的蛋白芯片，并具有较高的灵敏性、特异性和可靠性。Obeid等[44]建立了一个微流控芯片系统用来检测转基因大豆，仅需60 s 即可完成分析，产物检出限低至0.1%，相当于20个拷贝数。
在农兽药残留的检测方面，刘楠等[45]设计了一种可同时检测4种兽药、3种农药的液相芯片，整个检测过程仅耗时1-2 h。博奥生物技术有限公司构建了一种能够同时检测9种兽药残留的蛋白芯片平台，在3-5 h内能检测出猪肉等组织中的磺胺类、恩诺沙星、氯霉素、链霉素类等9种兽药残留量，已应用于多个地区的出入境检验检疫部门[46]。郭红斌等[47]成功制作出一种用于检测有机磷农药的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控传感器，简单的制备工艺和便携式的器件为集成化的有机磷农药检测装置提供了低成本和大批量生产的选择途径。 Xu等[48]用荧光偏振免疫分析技术进行蔬菜和水样品中的有机磷农药类的检测，能够同时检测5种有机磷农药，检测限为10 ng/mL，检测时间不超过10 min。
高通量检测技术在食品检测中的应用大大加快了食品检测的速度，与传统检测方法相比具有高通量、快速、灵敏度高的特点，但是还存在检测结果不够稳定，检测通量有待进一步提高等问题，若要进一步取代传统检测方法的地位还需要往更简便、更高效、更稳定的方向发展。
2.2 在医学领域中的应用生物医学的发展使人们逐渐认识到疾病的发生与发展与基因的变化和基因的表达水平密切相关，从基因和蛋白质水平去研究疾病更能揭示疾病的本质。高通量检测技术的发展为人们从分子生物学水平研究医学提供了快速、高效、可靠的检测手段，尤其是在于疾病的诊断和预警、药物的研究与开发等方面具有广阔的应用前景。
在疾病诊断和预警方面，高通量检测技术主要可用于传染病、自身免疫性疾病、肿瘤的检测。高通量分析技术因其快速、高效的特点对疾病的早期预防、快速诊断有重要意义。近年来，高通量分析技术应用于疾病的研究有很多，现将部分归纳，如表 2所示。
药物筛选是指用适当的方法对天然物质或人工合成的化合物进行药物活性检测，筛选出药靶用于新药的开发。传统的药物筛选多采用动物模型法，具有实验存在种属差异，周期长，成本高等缺点。高通量分析技术用于药物的筛选具有分析速度快、高通量、所用试剂量少等诸多优势，克服了传统药物筛选方法的不足。Li等[56]用基因芯片来探究中药的机制，寻找中药的药靶以及预测其治疗潜力，分析所开发药物的安全性。郑永焕等[57]设计了一种能够实现细胞区域分布培养以及能够对微流体进行操控的微流控芯片，通过对芯片3种共培养细胞活性的检测和药物伊立替康（CTP-11）对肝癌细胞的浓度梯度刺激等实验结果验证该芯片在细胞研究和药物筛选等方面的可行性。
高通量分析技术为疾病的快速、有效诊断以及药物的高效、低成本筛选提供了很多有效的方法，促进了生物医学在分子水平的研究，加深了人们对疾病的发生过程以及药物的作用机制的认识，有利于研究者更好地治疗疾病、开发药物。
2.3 在其他方面的应用除了上述两方面，高通量还广泛用于其他领域。在植物学方面，Li等[58]用基因芯片分析了青梅和杏的差异表达基因，找出两个基因在表达水平上有显著差异，为说明这两种果实在发育和成熟过程中的品质差异提供了详细的资料。谭小勇等[59]在建立各种病毒单项PCR 技术的基础上，通过优化多重PCR 反应条件，建立了能同时检测香蕉中3 种病毒的多重PCR 检测体系，对其灵敏度测试结果显示从相当于或大于10-2 mg 感病植物组织中均能检测到这3 种病毒。在土壤学方面，井赵斌等[60]用焦磷酸测序技术对黄土区不同封育时期典型草地土壤真核生物多样性进行了研究。结果表明不同封育时期草地真菌群落组成具有各自的优势菌群，动物群落组成仅在种水平存在差异，可以结合土壤微生物和土壤养分恢复时间的阈值对封育草地进行合理利用。在司法鉴定方面，Divne等[61]用焦磷酸测序技术进行STR（short tandem repeats）标记物的分析，这在法医DNA分析中非常有用。上海市公安局物证鉴定中心利用蛋白芯片技术建立了一种快速、高通量的毒品定量检测方法，检测结果与GM-MS仪器比较后总的相关性在88%以上，灵敏度高达99%。可见，蛋白芯片是一种大量、快速检测毒品的有效手段[62]。
3 结语高通量生物分析技术对于现代食品生物医药领域的发展意义重大，加快了检测效率、降低了检测成本、简化了检测过程，为致病菌的快速检测、疾病的提早预防、食品安全的有效保障等提供了多种全新、高效的检测方法。近年来，高通量分析技术主要朝着微量化、自动化、高灵敏度、高通量、低成本的方向发展。虽然目前还存在结果稳定性不好、检测灵敏度不够、背景值过高、检测标准不统一等问题，但随着众多研究者们不断对各种HTS技术进行优化和改进，高通量生物分析技术将为未来食品和生物医药领域的发展作出巨大的贡献。
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