制片技术是生物学工作者常用的一门实验技术，它是从事动植物生物技术、细胞生物学、结构植物学、植物生殖生物学、植物发育生物学等研究的必要技术基础，在生物科学领域占有重要地位。

石蜡切片法是组织学、发育生物学研究最常用的制片技术之一，广泛运用于临床病理诊断、教学和科研工作中。常规的石蜡切片制作过程是：取材→固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→染色→脱蜡→封片。传统使用的透明剂和脱蜡剂是二甲苯^{[1, 2]}，二甲苯是一种有芳香气味的刺激性、易挥发液体，有毒性，主要对中枢神经和植物神经有麻痹和黏膜刺激作用，是一种潜在的致癌物质。大量的动物实验研究表明，过多接触二甲苯会引起神经系统、肝脏、肺、皮肤等多个组织的毒性反应^[3-7]。二甲苯的细胞学毒性主要体现在诱导线粒体解偶联和氧化应激反应^[8]。接触和使用化学试剂的安全性可以从http://www.proscitech.com/网站上查询物质安全资料表（MSDS）得到。

由于二甲苯对人体危害大，广大科研工作者一直致力于寻找更加安全的二甲苯代替物。1978年，Maxwell曾提出可使用三氯乙烷作为透明剂，此后便有越来越多的技术人员使用该替代物^[9]，但由于三氯乙烷的蒸气仍然有毒，因此在实验过程中必须保持良好的通风状态^[10]。此后，多种二甲苯替代物，例如：植物油^[11]、葵酸丁酯^[12]、异丙醇^[13]、异丙醇-矿物油混合物^[14]、丙二醇甲酯^[15]、辛烷^{[16, 17]}、硬脂酸^[18]、松节油^[19]、环保透明剂^[20]、Y透明剂^[21]、甲基环己烷^[22]等被相继使用。

正庚烷是一种脂肪族烃化合物，无色易挥发液体，不溶于水，溶于醇，可混溶于乙醚、氯仿，熔点-90.5℃，沸点98.5℃，易燃，为汽油的组成成分之一，主要用作测定辛烷值的标准物^[23]。此前，已有研究者将正庚烷作为二甲苯的替代物，用于动物组织切片的透明和脱蜡过程，并取得良好效果^[24]。但正庚烷是否同样适用于植物组织切片，尚无人研究。本实验室多年来一直致力于被子植物受精与胚胎发生的研究，组织切片是本实验室研究的必要基础技术。本研究以拟南芥不同发育时期的花药切片为例，探究正庚烷替代二甲苯用于植物组织切片的可能性，拟为植物研究工作者提供借鉴。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 植物材料

野生型拟南芥（COL）温室种植（22℃，16 h光照/8 h黑暗）长至开花期，取新鲜花序进行后续实验。

1.1.2 试剂

FAA固定液（福尔马林5 mL，乙酸5 mL，50%乙醇90 mL），现配现用；无水乙醇，配成不同浓度备用；正庚烷（国药）；石蜡（Sigma）；多聚赖氨酸：粉末购自Sigma公司，称取20 mg多聚赖氨酸粉末溶于20 mL去离子水中，配成10×母液，-20℃保存；甲苯胺蓝染色液：粉末购自Sigma公司，称取1 g甲苯胺蓝粉末，溶于100 mL 70%乙醇中，4℃保存，使用时以双蒸水100倍稀释；加拿大树胶（Sigma）。

1.1.3 主要仪器

石蜡切片机（AO），恒温加热仪（瑞华），磨刀机（Leica SP9000），光学显微镜（OL-YMPUS IX71）。

1.2 方法 1.2.1 处理载玻片

用1%-2%盐酸乙醇（95%医用乙醇100 mL中加入浓盐酸1-2 mL）浸泡过夜→流水冲洗（放在塑料篮中）→取出后放入95%（医用）乙醇中备用。使用前擦干载玻片，均匀涂抹多聚赖氨酸水溶液，置于60℃烘箱烘1-2 h干燥。

1.2.2 固定

取新鲜的拟南芥花序，放入20 mL小瓶中，加满FAA固定液，抽真空辅助固定20-30 min，更换固定液后，4℃冰箱放置过夜。

1.2.3 脱水

50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇逐级脱水，材料在无水乙醇中脱水30 min，其他各级分别脱水1 h，最后一级脱水需更换2次无水乙醇。

1.2.4 透明

1/2无水乙醇＋1/2正庚烷→纯正庚烷→纯正庚烷逐级浸泡材料，每级放置1.5 h。

1.2.5 浸蜡

提前融石蜡，弃上一级正庚烷，配置体积比为1∶1的正庚烷/纯石蜡混合液，于58℃恒温台浸泡材料过夜，之后使用纯石蜡替换上一级溶液，每隔12 h换一次纯石蜡溶液，共替换6次。

1.2.6 包埋

将充分浸蜡的材料倒入已叠整齐的纸盒中，石蜡凝固前摆正材料方向，待石蜡凝固后放入4℃冰箱保存备用。

1.2.7 切片

切片前磨刀→分割、修整蜡块呈梯形→固定蜡块→固定切片刀，调节刀的角度到15°→调节切片厚度使其为10 μm→调节刀口与蜡块的距离、蜡块的位置→切片。

1.2.8 展片、粘片

将蜡带置于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，加蒸馏水展平蜡带后于42℃展片台上烤干。

1.2.9 染色

将玻片放入染缸，再将甲苯胺蓝染液加入染缸至淹没玻片，染色10 min，再用双蒸水清洗玻片，42℃烘箱中烘干。

1.2.10 脱蜡及封片

正庚烷浸泡玻片2次，每次10 min，取出玻片滴加加拿大树胶，盖上盖玻片封片。

2 结果 2.1 正庚烷代替二甲苯作透明剂

材料经固定及各级乙醇脱水后，再用正庚烷逐步透明。结果（图 1，图 2）显示，处理后的组织呈半透明状态，且能保持平整，无收缩、变形现象；浸蜡后切片，容易连续切片而且厚薄均匀，摊片时能在42℃水中自然展开，平整而无皱褶，说明以正庚烷作透明剂，不仅能与脱水剂充分混合，又能被石蜡完全取代，透明效果好，是一种合适的透明剂。

2.2 正庚烷代替二甲苯作脱蜡剂

展片、烘片、染色以后，用正庚烷浸泡玻片2次，每次10 min。结果（图 3）显示，仅剩下植物组织仍保持在原位，用于支撑组织和细胞的石蜡已被完全溶解，组织、细胞更加透明清晰，便于观察；用正庚烷溶去组织内外的石蜡只需要20 min，脱蜡快而干净，表明正庚烷是一种合适的脱蜡剂。

2.3 光学显微镜下花药形态的观察

脱蜡后的组织经封藏剂封藏后，便可以长期保存，显微镜下观察切片，结果（图 4）显示，甲苯胺蓝染色颜色鲜亮，细胞着色好，核质分明，结构清晰，组织形态保持完好，能达到以二甲苯作透明剂的石蜡切片效果。

3 讨论

在组织制片实验中，透明和脱蜡是两个十分重要的步骤，透明是脱水与浸蜡、脱水与封藏之间的桥梁，而切片后需要用脱蜡剂溶去组织和细胞内外的石蜡，才能使细胞、组织更加透明清晰，便于观察。传统使用的透明和脱蜡试剂是二甲苯，二甲苯是含苯环的芳香族化合物，毒性高，虽然已有各种二甲苯替代物被开发使用，但是却未普及：或因效果不稳定，或因价格较高^[25]，因此，新的、更加安全有效的二甲苯替代物亟待研发。

二甲苯具有慢性毒性，经常或反复侵入人体后会引起神经衰弱、植物神经紊乱或皮肤黏膜刺激等症状，具体如头痛、头晕、乏力、睡眠障碍、血压降低、轻度贫血、皮炎等表现^[26]。对妊娠期妇女还会导致妊娠贫血、妊娠高血压综合征、自然流产等症状，对月经机能、生殖机能和子代发育有一定的影响和损害^[27]。另有文献报道，苯类化合物在一定程度上会引发牙周组织疾病^[28]。而正庚烷只是对直接接触的皮肤有轻度刺激性，并具有麻醉作用。国家标准职业性接触毒物危害程度分级，将二甲苯定为III级（中度危害），溶剂汽油（正庚烷为其组成成分之一）为IV级（轻度危害）^[29]。

正庚烷是短链脂肪烃化合物，相比于芳香烃二甲苯，正庚烷与石蜡结构更为相似，溶解石蜡也更加迅速。常规二甲苯脱蜡时间为每次20 min，正庚烷脱蜡时间为每次10 min，脱蜡快而干净。以正庚烷为透明剂，透明效果好，处理后的材料呈半透明状，后续浸蜡充分，容易连续切片，不脱片，摊片时能在42℃水中自然展开，平整而无皱褶。本实验研究发现，经正庚烷处理后的组织染色效果好，甲苯胺蓝染色10 min即可，颜色鲜亮，核质分明，结构清晰，解决了植物油等二甲苯替代物染色不佳的问题。

在实验中，应用正庚烷需要注意的是：正庚烷易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，应远离火种，密封、避光保存；有一定的挥发性，用完及时盖严。为了脱水彻底并使材料减少收缩，透明时可逐步从纯乙醇过渡到正庚烷，即1/2无水乙醇＋1/2正庚烷→纯正庚烷→纯正庚烷（正庚烷应更换2次，以除尽乙醇）。

正庚烷作为一种新的、相对安全有效的二甲苯替代物，有望在植物组织切片中普及使用。拟南芥是植物研究的模式植物之一，花药是植物生殖生物学的重要研究对象。本研究成功地将正庚烷应用于拟南芥花药石蜡切片实验，下一步应选取更多种类的植物材料及更多样化的组织开展实验，以期将正庚烷普遍应用于植物制片技术，消除二甲苯对制片人员的危害，改善工作环境。

4 结论

本研究对拟南芥不同时期的花药进行石蜡切片，通过使用正庚烷作为透明剂和脱蜡剂，消除了传统透明试剂二甲苯对实验人员的危害。用正庚烷处理材料，透明效果好，浸蜡充分，容易连续切片，脱蜡快速且干净，染色佳，组织结构保持完整。因此，正庚烷可以作为一种新的、相对安全有效的二甲苯代替物，应用于植物组织切片中。