油脂不仅是人类和动物不可或缺的食物，也是重要的工业原料，具有较高的经济价值^[1]油料种子积累的油脂主要以三酰甘油（triacylglycerols）的形式存储于油体中，为种子萌发和形态建成提供碳源和能量^[2]。三酰甘油是丙三醇和脂肪酸的酯化物，主要通过Kennedy途径合成^[3,4]。

模式植物拟南芥属于十字花科植物，其种子含油量高，是研究脂代谢的理想载体。通过分析拟南芥基因表达谱发现，在不同发育阶段，质体中的乙酰CoA羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）4种亚基（BC、BCCP、α-CT和β-CT）的表达量几乎不变^[4]；参与同一个代谢过程的多数基因具有相似的表达谱^[5]，表明转录调控在油脂合成过程中具有重要作用，从而为高油作物遗传育种工作指明了方向。WRINKLED1（WRI1）是目前唯一确定的特异性正向调控糖酵解和脂肪酸合成过程的转录激活因子，具有重要研究意义^[6]。近年来已相继在拟南芥、油菜、玉米等多种植物中找到了该基因，并对AtWRI1的生物学功能做了深入研究。丁霄等^[7]报道了WRI1在主要作物中的研究现状。综述了拟南芥AtWRI1的研究进展，主要从AtWRI1的发现、表达模式、生物学功能和调控机制加以阐述，为将来WRI1的深入研究提供参考。

1 AtWRI1的发现及其结构特征

一般而言，油脂密度小于蛋白质和碳水化合物。因此，如果种子含油量降低，种子密度则会相应增加。基于这样的假设，1998年，Focks和Benning^[8]对经化学诱变处理获得的M2群体通过种皮形态结构和密度的观测，筛选到包括wri1-1在内的若干等位拟南芥突变体 。wri1-1突变体种子胚中的质体丙酮酸激酶（plastidial pyruvate kinase，PKp）的活性仅为野生型的28%，甚至比pkpβ1pkpα双突变体更低^[9]，这说明了WRI1的重要性。与表面皱缩的豌豆相似^[10]，由于种皮发育正常而脂类物质含量减少，wri1突变体种子干燥后发生明显皱缩，因此该基因被命名为WRINKLED1（WRI1）。wri1-1在种子淀粉含量，形态建成和光合能力方面与野生型拟南芥没有差异，但种子（包括胚乳和胚）含油量大幅下降，油体结构异常^[11]，脂肪酸组分发生变化，可溶性糖含量增加，蛋白含量略有减少，种皮褶皱，胚发育延缓，下胚轴生长不正常，发芽率和可育性降低。通过对该突变体进行遗传作图、酶活测定和转录组测序等实验证实了AtWRI1是一个与油脂合成相关的转录激活因子，调控糖酵解和脂肪酸合成效率。Cernac和Benning^[12]通过图位克隆和遗传学方法确定了AtWRI1的基因座（At3G54320）。

AtWRI1具有两个AP2结构域，定位在细胞核，属于AP2/EREPB家族中的AP2亚族，与胚珠及花发育相关转录因子AINTEGUMENTA（ANT）具有较高的相似性^[13]。在NCBI的GENE数据库中显示WRI1同源基因具有相似的内含子-外显子结构。包括AtWRI1在内的多数WRI1基因具有7个外显子，其中第三个外显子仅含9个核苷酸，高度保守，对应WRI蛋白第一个AP2结构域内的3个氨基酸残基（VYL）（图 1）。这3个氨基酸对AtWRI1的生物学功能具有重要作用^[14]。AtWRI1具有At3G54320.1、At3G54320.2和At3G54320.3三种剪接体，但在拟南芥种子和其他组织的转录组数据库中仅检索到At3G54320.3。目前关于AtWRI1的研究均以At3G54320.3为研究对象，本文中的AtWRI1均指At3G54320.3。

2 AtWRI1表达模式与功能研究

基因表达模式与其功能密切相关，深入研究WRI1的表达模式有利于开展其功能研究。AtWRI1在种子、茎、叶、根和花中都有表达，但在种子中表达量最高^[12]。糖酵解过程为脂肪酸合成提供原料，该过程的关键基因PKp1和PKp2在胚中的表达模式与AtWRI相近，对应的突变体表型与wri相似^[15]，反映了AtWRI1在糖酵解调控过程中的重要作用。糖异生过程涉及到许多糖酵解相关酶，存在于各个器官与组织中，说明AtWRI1在茎、根等器官中有少量表达。将AtWRI1的启动子区域（起始密码子前的1 028 bp）和报告基因GUS构建表达载体并在拟南芥中表达发现，AtWRI1在胚和胚乳发育的早期已有少量表达；到鱼雷形胚时，在胚根和子叶外围的表达较强；随着胚的发育，逐渐向子叶内部扩展，但在种皮中始终未见表达。拟南芥油脂主要在胚和胚乳中积累，AtWRI1表达的组织特异性与之一致。在开花后第8-10天，AtWRI1在角果中的表达达到峰值，恰好是种子开始积累油脂的阶段。之后其mRNA丰度缓慢降低；但到种子成熟阶段其表达维持在较低水平还是快速增强还存有争议^[12,16]。

突变体是功能基因组学研究的重要材料，目前TAIR已收集到5个wri等位突变体，其中wri1-1在第一个内含子的第一个碱基发生点突变（G>A）导致异常剪接，不能正常翻译出该转录因子，进而不能正常积累油脂。2002年，Ruuska等^[5]对不同发育时期wri1-1种子的转录组数据进行分析发现，与野生型拟南芥种子相比，其1%基因的表达受到显著影响，绝大多数是在野生型拟南芥中具有单峰表达谱的碳水化合物代谢相关基因或脂肪酸从头合成相关基因。转录激活因子与其靶基因具有相似的表达模式，并且在表达丰度上呈正相关^[17]。利用基因芯片杂交、定量PCR和Western-blot等技术分析wri1突变体和AtWRI1超量表达株的基因表达明确了AtWRI1的转录调控作用。目前已确定其靶基因多是糖酵解相关基因和脂肪酸从头合成相关基因，在野生型拟南芥中具有相似的表达谱。多数靶基因在突变体中仍有本底表达，与酶活测定的结果相一致^[18]，而多数靶基因在AtWRI1超量表达株中表达量增加，虽然增加幅度远不如AtWRI1。wri突变体中的靶基因的本底表达表明AtWRI1是在种子发育的特定阶段激活相关基因的表达，而另有其他功能因子维持这些基因的本底表达。二酰甘油酰基转移酶（Acyl-CoA：diacylglycerol acyltransferase1，DGAT1）、蔗糖合成酶（sucrose synthase，SUS2）和脂肪酸延长酶（fatty acid elongase1，FAE1）在wri突变体中表达减弱，但AtWRI1的超量表达没有使之表达增强，且它们的表达谱与其他靶基因不同，推测AtWRI1需要与其他功能因子协同作用才能转录激活这些基因^[19]。在超量表达株中，AtWRI1和其靶基因表达水平不同幅度的提升也证明了这一观点。AtWRI1和其靶基因之间在表达上存在一定的时间差。wr-1i中脂肪酸修饰或Kennedy途径相关基因的表达没有受到明显影响，AtWRI1超量表达株和wri突变体中脂肪酸组分的变化与之相一致。AtWRI通过调控糖酵解和脂肪酸合成过程促进油脂合成，而不直接参与脂肪酸修饰和三酰甘油合成过程。由Nitrogen Regulatory Protein PII 1-like（GLB1）编码的PП蛋白通过影响ACCase活性从而负向调控脂肪酸生物合成^[20,21]。AtGLB1也被AtWRI1正向调控，体现了生物调控网络的复杂性与精密性。此后，To等^[22]又获得了AtWRI1的3个旁系同源基因，即AtWRI2、AtWRI3和AtWRI4。AtWRI2在不同组织都有表达，但不能转录激活AtWRI1的靶基因，这可能是由于它的第二个AP2结构域存在较大变异而导致的。AtWRI2没有参与到油脂合成的调控过程中，可能具有其他的生物学功能，目前对该基因的研究较少。AtWRI3和AtWRI4主要在叶和花器官中表达，也能促进脂肪酸合成，对应突变体花瓣表面角质中的双羧基脂肪酸和ω-羟基脂肪酸含量减少，花瓣粘连在一起。AtWRI3和AtWRI4调控角质中脂肪酸的合成，而AtWRI1调控储存脂中脂肪酸的合成，三者在功能上既相互联系又相互区别。需要说明的是，对于不同基因型的拟南芥，WRI1促进油脂合成的能力不同，这可能是由内源基因表达模式决定的^[23]。Ws型拟南芥中油脂合成相关基因的表达水平不是限制油脂合成的因素；因此就促进油脂合成的作用而言，在Ws中AtWRI1的超量表达作用不如在Col中明显。

Maeo等^[19]将报告基因GUS与AtWRI1靶基因的启动子区域构建表达载体和AtWRI1共转入拟南芥原生质体中确定了与AtWRI1结合的顺式作用元件。通过序列分析发现AtWRI1靶基因启动子区域内具有保守性较强的序列，被称为AW-box［CnTnG］（n）₇［CG］（n为任意核苷酸）。许多AtWRI1靶基因启动子区域具有2个AW-box，都是具有功能的顺式作用元件。AW-box紧邻转录起始位点（TSS）或在5'UTR内，与TSS的距离应不超过400 bp，否则不能特异性表达。Tabach等^[24]曾报道CArG-box及NF-KB-motif的转录激活效率及其与TSS之间的距离直接相关。2个AW-box之间的距离也能影响WRI1的转录激活的组织特异性^[25]。两个核心motif即［TnCnG］和［CG］被7个任意核苷酸隔离，核心motif上发生任意点突变都会减弱AtWRI1蛋白与它的结合程度。AtWRI1定位在细胞核，完整的结构是其生物学活性的前提^[26]。这两个motif可能分别与AtWRI1蛋白的两个AP2结构域发生作用。Baud等^[23]确定了AtWRI1靶基因启动子区域内的另一个顺式作用元件，即15-bp element（5'-cAAAAG（t/g）Agg（a/g）gttT-3'）。通过分析转录组数据发现在油棕中果皮表达的若干油脂合成相关基因也具有AW-box，但没有发现15-bp element^[27]。AtWRI1靶基因启动子区域内还存在其他保守性较低的元件，或许也能与AtWRI1蛋白或其他因子相互作用。基因的表达与调控是一个复杂的过程，这两个不同的顺式作用元件可能在依赖AtWRI1的调控网络中具有不同的作用。另外，通过酵母单杂交实验发现BnWRI1能够与GT1-element和GCC-box发生作用，说明不同物种之间依赖WRI1的调控机制也不尽相同。

3 AtWRI1调控机制

植物具有复杂的代谢调控网络以适应不断变化的环境和不同的发育状态。转录因子调控靶基因的表达，因此对于转录因子的调控至关重要^[28]。AtWRI1在拟南芥中存在转录和转录后两个不同水平的调控机制。LEC2与胚发育相关，能够激活AtWRI1的表达^[29,31]，而lec2突变体中AtWRI1的表达下降，表达谱改变，在wri1-1突变体中超表达AtLEC2不能增加种子油脂含量。这些说明AtLEC2是AtWRI1的上游基因，其功能的发挥需要AtWRI1的介导。AtLEC2的另一个下游基因AtLEAFY COTYLEDON1（LEC1）也正向调控AtWRI1的表达^[32]。wri1-1突变体中mRNA丰度异常高，表达谱也发生变化，AtWRI1活性的干扰实验也得到类似的结果，推测拟南芥中存在着反馈调节机制调控AtWRI1的表达。选择性剪接是许多基因的调控方式^[33]，AtWRI1也存在选择性剪接。AtWRI1第三外显子仅有9个核酸，属于micro-exons^[34]，对应AtWRI蛋白第一个AP2结构域内“VYL”3个氨基酸残基（图 1）。这3个氨基酸在WRI同源基因中高度保守，具有重要作用，且多数由第3个仅含9个核苷酸的外显子翻译而来。该外显子的作用可能是调控AtWRI1的转录激活^[35]。许多转录因子通过复合体（同源或异源）的形式发挥作用，而在截短或修饰后则能干扰复合体的形成或其转录激活作用^[36]。AtWRI1具有不同的剪接体，是否存在这种调控机制仍需进一步研究。转录因子的泛素化和之后通过26S蛋白酶体的降解对于其功能的实现具有重要作用。蛋白泛素化是一个极为复杂的过程，植物体内有近1 500种蛋白-泛素连接酶（E3），CULLIN-RING泛素连接酶（CRL）是其中主要的一种。BTB/POZ-MATH（BPM）在C端和N端分别具有BTB/POZ和MATH结构域^[37]，在ERF/AP2家族蛋白的泛素化过程中具有重要作用^[38]。CRL3是CRL的一个亚族，能与BPM形成复合体以泛素化AtWRI1蛋白，被泛素化的AtWRI1蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解。

4 展望

代谢过程中的一个酶促反应对于整个过程的影响是有限的^[39]，而WRI1可在种子发育的特定阶段单独起作用或与其他作用因子相结合，转录激活参与糖酵解和脂肪酸合成过程中的重要基因，从而影响油脂合成过程。目前已一定程度地了解了AtWRI1的调控网络（图 2），是基因改良工程可行的重要基因；若结合其他基因的操控能更为有效地提高植物种子或营养器官的含油量，改变脂肪酸组分^[40,41]，因此WRI1具有很高的应用价值。

AtWRI1在油脂合成过程中具有重要作用，理解AtWRI1的作用机制是利用该基因促进油脂合成的基础，在如下几个方面仍需深入研究。（1） AtWRI1存在不同的剪接体，但目前对AtWRI1的选择性剪接和不同剪接体的功能研究较少。（2） AtWRI1异常表达会引起发芽率降低，形态建成不正常，目前还无法确定是由AtWRI1的异常表达直接引起，还是由油脂含量异常、代谢状态改变、信号转导受阻等因素间接引起。（3） 在AtWRI1超量表达株中，相对于AtWRI1表达量的增加，其靶基因的表达量并没有大幅增加；酵母双杂交实验发现AtWRI1可以自激活，推测AtWRI1蛋白以二聚体或多聚体（同源或异源）形式发挥转录激活功能，其机理尚需进一步研究。（4） AtWRI启动子区域顺式作用元件及其蛋白三维结构特征的分析有利于揭示它的作用机制。（5）AtWRI1蛋白的减少会引起AtWRI1转录水平的提高，关于AtWRI1的反馈调节机制需进一步研究。