钙调素（calmodulin，CaM）作为一类细胞内Ca2+的受体，绝大多数无酶活性，也无转录因子活性，更不是结构蛋白，只有通过其下游的钙调素结合蛋白（calmodulin-binding protein，CaMBP）来调节细胞的生理功能[1-3]。因此，研究CaBMP对揭示CaM的功能至关重要，将有助于解析CaM信号通路的特异性、复杂性和多样性。CaM与CaMBP的结合可分为Ca2+依赖和不依赖两种类型。其中，Ca2+不依赖型的CaMBP含有IQ基序，完整IQ基序的氨基酸序列为IQXXXRGXXXR或[I/L/V]QXXXRXXXX[R/K][4, 5]，但是，极少数含IQ基序的蛋白质与CaM的结合也依赖Ca2+[6, 7]。在植物中已经发现了5个含IQ基序的蛋白质家族[8]：myosin家族[9-11]、CAMTA家族[12, 13]、CNGC家族[14, 15]、IQD家族[6, 7, 16]和IQM家族[17-19]，分别由17个、6个、20个、33个和6个成员组成。在拟南芥中，IQM家族共有6个成员，均只含有1个能与钙调素结合的IQ基序[20]。IQM1（IQ motif containing 1）是IQM家族的1个成员，由At4g33050编码，IQM1在体内外均能与CaM结合，并通过蛋白截短实验证明IQ基序是其钙调素结合所必需的结构域[17]；本研究组将克隆得到的全长cDNA进行生物信息学分析发现，IQM2也是1个钙调素结合蛋白[21]；IQM3的启动子中存在多种光、非生物胁迫和植物激素反应的顺式作用元件，IQM3基因与种子萌发及幼苗子叶膨大有密切关系[22]。IQM5是该家族的第5个成员，由At5g57010编码，其功能尚待研究。检索生物学文献和数据库发现IQM5基因存在一种剪切方式，即IQM5.1。已知，IQM1存在4种不同的剪切方式（见www.arabidopsis.org）。鉴于此，本研究对不同生长发育时期的RNA样本进行RT-PCR扩增和测序，以探究IQM5是否也存在不同的剪切方式，并对因不同的剪切方式所产生的转录本进行定量RT-PCR分析，旨为进一步解析该基因的功能奠定必要的基础。
1 材料与方法 1.1 材料植物材料：拟南芥（Arabidopsis thaliana）生态型为Columbia（Col）；大肠杆菌菌株为E. coli DH5α；T-A克隆载体为pMD19-T Simple vector，购自TaKaRa公司；总RNA提取试剂盒（RNAiso Plus）、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR®PrimeSc riptTM RT-PCR kit（Perfect Real Time）、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA片段回收试剂盒、DNA Ligation Kit和PCR相关的试剂及Taq酶均为宝生物工程（大连）有限公司产品；氨苄青霉素钠、硫酸卡那霉素、蛋白胨、酵母抽提物、蔗糖、琼脂粉、各种氨基酸、NaCl等试剂均为生工生物工程上海股份有限公司产品。
1.2 方法 1.2.1 总RNA的提取采用 Trizol 法，从7d幼苗、成熟植株不同器官中提取总 RNA。
1.2.2 不同转录本的克隆以7 d幼苗和成熟莲座叶的总RNA为模板，以5'-atggctttatcttttggttactta-3'和5'-ttagtgccttgggcttggaagacc-3'为引物进行RT-PCR扩增，得到IQM5CDS。RT-PCR参数为：50℃反转录30 min，94℃变性2 min；94℃变性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸2 min，共 33个循环；72℃延伸5 min。反应结束后电泳，并用凝胶成像系统（AlphamagerTM）观察、拍照，切取目的片段所在的凝胶，用胶回收试剂盒回收扩增产品，与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌，筛选出阳性菌落，进行菌落PCR，选择阳性菌落摇菌，菌液外送测序，并用生物信息学的方法分析测序结果。
1.2.3 基因表达分析 1.2.3.1 cDNA的获得参考PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）的操作手册进行。先用其中的gDNA Eraser除去RNA中的基因组DNA后，再进行反转录获得cDNA，最后进行PCR 检测，以确认 DNA是否除尽。
1.2.3.2 半定量RT-PCR以1.2.3.1所获得的cDNA为模板，进行PCR扩增。所用引物为IQM5.1-F1：5'-AAGTTTACCAGCACCGAC-3'；IQM5.1-R1：5'-GCA-GCAAGATTTCTACGC-3'；IQM5.2-F2：5'-CGTATG-TACACATGGTCTTC-3'，IQM5.2-R2：5'-ACACTTCG-TAAGCTTGTCTC-3'；Actin2-F：5'-TGACTACGAGC-AGGAGATGGAA-3'，Actin2-R：5'-CAAACGAGGGC-TGGAACAA-3'。扩增程序为：94℃变性2 min；94℃变性30 s，62℃（Actin2）或51.5（IQM5.1IQM5.2）退火30 s，72℃延伸10 s，共28个循环；72℃延伸5 min。反应结束后，用浓度为2%的琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶成像系统观察并拍照。
1.2.3.3 实时定量RT-PCR用SYBR®PrimeSc riptTM RT-PCR kit（Perfect Real Time），相关耗材为Applied Biosystems（ABI7000）公司产品。所用基因专一引物同半定量RT-PCR，模板（1.2.3.1所获cDNA）浓度为0.5 ng·L- 1，每个样品设3次重复。选用表达相对稳定的Actin2作为内参基因，以IQM5.2的相对表达量作为参照因子（即1倍）。采用△△Ct法进行基因表达的相对定量分析，即利用 2-△△Ct公式计算IQM5.1基因与IQM5.2基因的相对比例（样品的△Ct=IQM5.1基因/IQM5.2基因的Ct -Actin2Ct，△△Ct=IQM5.2基因△Ct - IQM5.1基因的△Ct）。
2 结果 2.1 IQM5.2的发现以7 d幼苗总RNA为模板进行RT-PCR，将扩增产物克隆进测序载体，转化大肠杆菌，随机选送5个菌落直接PCR呈阳性的菌落外送测序。测序结果显示，全部为IQM5.1。而在以成熟莲座叶总RNA为模板进行的RT-PCR所获得 9个序列中，3个与IQM5.1完全匹配，另外6个序列都存在1个长75 bp的与IQM5.1不匹配的片段。进一步分析发现，这个75 bp的片段与IQM5.1的基因组序列的第6个内含子（1 345-1 419 bp）完全匹配（图 1）。说明IQM5基因至少存在2种不同的剪切方式，其转录本分别为IQM5.1和IQM5.2。
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| 图 1 所得75 bp片段与IQM5基因的第6个内含子的比对 |
如上所述，在成熟植株的莲座叶中发现了一个新的IQM5基因的mRNA——IQM5.2。经过生物信息学分析得知，IQM5.2源于IQM5.1的第6个内含子未被剪切。该内含子两端的碱基为“GT-AG”（图 1），属于第二类“GT-AG”内含子。据此，IQM5基因由IQM5.1的8个外显子拼接为IQM5.2的7个外显子（图 2）。
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| 图 2 IQM5.1（A）和IQM5.2（B）的剪切方式示意图 |
IQM5.1基因的cDNA全长1 783 bp，编码1个由495个氨基酸残基组成的多肽链（NP_200511.1）。IQM5.2 的cDNA全长1 858 bp，编码1个由300个氨基酸残基组成的多肽链（KT851542）（图 3）。这是由于在多出的75 bp的第70-72位核苷酸残基为终止密码“TAA”（图 1-图 3）所致。
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| 图 3 IQM5.2的cDNA及其编码蛋白 |
用ExPASy的ProtParam软件预测，IQM5.1的分子式为C2474H3925N723O736S18，相对分子质量约为56 kD，酸性氨基酸（Asp + Glu）残基58个，碱性氨基酸（Arg + Lys）残基77个，等电点（pⅠ）为9.44，半衰期为30 h，不稳定参数（the instability index，Ⅱ）是41.89，属于不稳定蛋白。该蛋白亲水性平均数（grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.676，预测为亲水蛋白。
2.4 IQM5.2的理化性质用ExPASy的ProtParam软件预测，其分子式为C1528H2427N443O444S9，相对分子质量约为34 kD，酸性氨基酸（Asp + Glu）残基37个，碱性氨基酸（Arg + Lys）残基51个，等电点（pⅠ）为9.50，半衰期为30 h，不稳定参数是46.11，属于不稳定蛋白。该蛋白亲水性平均数为-0.688，预测为亲水蛋白。
2.5 功能预测经序列比对发现，IQM5.1的 N端与豌豆重金属诱导蛋白6A（HMIP6A）[23]、C端与栝楼天花粉素（trichosanthin）的N端[24]具有较高的同源性，第130-152位氨基酸残基为IQ基序（图 4）。IQM5.2与豌豆重金属诱导蛋白6A（HMIP6A）[23]具有较高同源性，第130-152位氨基酸残基为IQ基序（图 5）。HMIP6 A是在用汞、镉和铝处理的豌豆根中被发现的，具有一个含IQ基序的重复序列[23]，而IQM5.1和IQM5.2均具有其中一段。提示，IQM5.2可能具有与HMIP6A相似的特性。天花粉素是从葫芦科植物栝楼（Trichosanthes kirilowii）新鲜块根中提取的植物蛋白质，属于Ⅰ型核糖体失活蛋白[24]。与IQM5.1相比，IQM5.2缺少了天花粉素同源区段。
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| 图 4 IQM5.1与豌豆重金属诱导蛋白6A（HMIP 6A）及栝楼天花粉蛋白（Trichosanthin）的序列比对 *氨基酸相同；+氨基酸功能相似；▲/♠IQ motif关键氨基酸残基/天花粉蛋白的关键氨基酸残基 |
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| 图 5 IQM5.2与豌豆重金属诱导蛋白6A（HMIP 6A）的序列比对 *氨基酸相同；+氨基酸功能相似；▲ IQ motif关键氨基酸残基 |
为了进一步分析IQM5.1和IQM5.2在不同器官中的表达比例，选取了７d幼苗、成熟植物的莲座叶、花序叶、茎和花蕾等5种不同材料进行半定量和定量RT-PCR分析。定量RT-PCR分析结果显示：若以同一材料中的IQM5.1的表达量作为1个单位，除花蕾中AtIQM5.2比IQM5.1的相对表达量低外，其他4种材料中IQM5.2比IQM5.1的表达量高（图 6-B）。半定量RT-PCR分析结果（图 6-A）印证了定量RT-PCR分析的结果。
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| 图 6 AtIQM5.1和AtIQM5.2转录本的半定量（A）和定量（B）RT-PCR分析 |
本研究在生态型为Columbia（Col）的拟南芥中发现了一种IQM5基因的新的剪切方式，由IQM5.1的第6个内含子未被剪切所致，所产生的mRNA被命名为IQM5.2。与IQM5.1蛋白相比，IQM5.2蛋白缺少了天花粉素同源区段，但IQM5.2蛋白仍然保留了与HMIP6A同源的含IQ基序的区段，可能具有与HMIP6A相似但不同于IQM5.1的功能。本研究组多年从事拟南芥IQM家族的研究，利用截短蛋白所进行的实验发现IQ基序是IQM1与CaM结合的位点[17]；进一步发现，若将IQ基序中的Ⅰ突变成S，IQM1同样不能与CaM结合[25]；在IQM2的钙调素结合活性的研究中，本研究组得到了相同的结果（待发表）。因此，推断IQM5.2蛋白可以与CaM结合，并且很可能是不依赖Ca2+的CaM结合蛋白，具体特性还有待进一步研究。半定量和定量RT-PCR分析结果显示，5种不同材料中都存在IQM5.1和IQM5.2的转录本，且二者的比例在不同的材料中不尽相同。因此推测，二者的比例可能与发育调节有关，其间的具体关系则有待深入研究。
4 结论发现AtIQM5基因的一种新的转录本IQM5.2，并在拟南芥生态型为Columbia（Col）的幼苗、莲座叶、花序叶、茎和花蕾中均存在IQM5.1和IQM5.2两种转录本，且二者的比例在不同器官中不尽相同。
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