病毒性肝炎是一个全球性的健康问题，尤其是戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的戊型肝炎^{[1, 2]。戊型肝炎病毒为单链RNA，无包膜病毒，属于肝炎病毒科肝炎病毒属[3-6]。以往的研究提出了4种HEV的传播途径，分别为粪-}口传播、食源性传播、输血和母婴垂直传播^[7]。感染戊型肝炎病毒可导致体内长期的凝血和胆汁淤滞，并且还会提高孕妇的死亡率^[8-10]。近年来研究还表明，戊型肝炎病毒感染除了提高孕妇的死亡率之外，还会导致男性和非妊娠妇女的死亡^[11]。在孕妇中产生高死亡率的原因尚不明确，也没有具体的治疗方法，同时，HEV促进疾病进展的细胞蛋白质和途径仍不明确。这些都归根于HEV难以分离及纯化、同时缺乏稳定的HEV细胞感染培养系统，阻碍了对HEV生物学的理解。

1983年首次用戊肝患者的粪便提取物成功感染了2只猕猴，成为了戊型肝炎动物实验的先例^[12]。此后国内外学者陆续发现有10多种灵长类动物品系和猪对HEV易感，适宜于做动物模型。但灵长类动物具有昂贵、来源有限、实验条件要求高等缺点。随后，研究人员发现野鼠可自然感染HEV，但选用野鼠作为动物模型也具有一定的风险，并且其来源也相对有限。

长爪沙鼠（Meiiones unguiculataus）亦称蒙古沙鼠，是一种具有广阔开发前景的多功能性啮齿类实验动物，并且在医学研究领域里作为实验动物已有20-30年的历史。其某些特有的生理学、解剖学和行为学特征对于多种疾病的研究具有重要价值，如脑血管疾病、营养代谢病和自发性肿瘤等^[13]。长爪沙鼠不仅对多数病原易感，而且在某些病原感染下，会表现出与人类相似的病理特征和临床症状。因此，长爪沙鼠作为一种“多能”性实验动物，具有非常重要的开发利用价值。

本研究拟用猪源HEV病毒感染长爪沙鼠，通过RT-PCR检测，组织病理学观察等方法，探索将长爪沙鼠作为HEV感染模型的可能性。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 毒株

猪HEV阳性粪便采自长春某猪场，经RT-PCR鉴定为阳性、属基因Ⅳ型，-70℃保存。

将阳性粪便用PBS制成1∶10的悬液，4℃，4 000 r/min离心20 min，取上清，用0.22 μL无菌滤器滤过除菌，测定RT-PCR滴度后备用。

1.1.2 实验动物

40-50日龄的长爪沙鼠获赠于浙江省疾病预防控制中心。

1.1.3 检测试剂盒

双抗原夹心ELISA检测试剂盒购自北京万泰生物药业公司；TRIZOL Reagent购自Invitrogen公司；Ultrasensitive^TM S-P超敏试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 方法 1.2.1 长爪沙鼠人工感染实验

选取检测为HEV阴性的健康长爪沙鼠24只。每只沙鼠分别以腹腔接种及口服接种的途径接种方法1.1.1中处理后的HEV阳性材料0.5 mL，并连续观察50 d。分别在7、14、21、28、35和50 d无痛处死2只长爪沙鼠，并采血及分离血清检测HEV抗体和检测HEV RNA，同时采集心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、脾脏、小肠、回肠、直肠检测HEV RNA。

1.2.2 HEV抗体检测

使用北京万泰生物制药公司提供的抗-HEV抗体酶联免疫试剂（双抗原夹心法），按照说明书检测血清中抗-HEV抗体并判断结果。

1.2.3 HEVRNA的RT-PCR检测 1.2.3.1 引物设计

根据GenBank中注册的HEV各基因型的保守区序列，设计一套简并引物，以M1、M2为外引物；M3、M4为内引物。

M1：5'-AAC（T）TATGCA（C）CAGTACCGG-GTTG-3'（5 725-5 746 bp）；M2：5'-CCCTTATCCTG-CTGAGCATTCTC-3'（6 433-6 455 bp）；M3：5'-GTC（T）ATGC（T）TGCATACATGGCT-3'（6 010-6 031 bp）；M4：5'-AGCCGACGAAATC（T）AATTCTGTC-3'（6 336-6 357 bp）。

1.2.3.2 HEV正链RNA的RT-PCR检测

按照TRIZOL Reagent说明书提取HEV RNA。取RNA 14 μL加1 μL的Oligo（dT），于75℃加热5 min后迅速冰浴10 min，然后加入5×M-MLV buffer 6 μL，dNTP 1.5 μL，RNasin 1 μL，M-MLV 1 μL，双蒸水6.5 μL，混匀后42℃ 1 h，95℃ 5 min，-20℃ 30 min。

取上述合成的cDNA进行两轮PCR。首轮使用的引物为M1和M2，PCR扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃延伸10 min。第二轮使用的引物为M3和M4，PCR扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃延伸10 min。

1.2.3.3 HEV负链RNA的RT-PCR检测

对检测到HEV 正链的RNA的样品，进行HEV负链RNA的RT-PCR检测。

1.2.4 免疫组织化学观察

先将组织制成常规石蜡切片，经脱蜡和脱水后对组织抗原进行相应的修复。加过氧化酶阻断液，室温下孵育10 min。然后在每张切片中先后加入50 μL正常非免疫动物血清、50 μL兔抗p293（ORF2 aa382-674）抗体（1∶1 000）及50 μL生物素标记的二抗，分别在室温下孵育1 h、1 h及10 min。再往切片加入50 μL链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育10 min。最后往切片加入100 μL DAB溶液，作用3 min左右后，冲洗干净，苏木素复染，再冲洗干净；切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固后显微镜下观察。

1.2.5 病理组织学观察

将待观察的病料用10%中性甲醛溶液固定及石蜡包埋后，以3.5 μm 的厚度连续切片，经常规苏木素-伊红染色后显微镜下观察。

2 结果 2.1 粪便悬液的RT-PCR滴度测定

粪便悬液经10递倍稀释后，RT-PCR检测结果见表 1。计算结果表明，接种用猪粪便悬液的RT-PCR滴度为10^-6.78。

2.2 ELISA检测人工感染长爪沙鼠HEV抗体

长爪沙鼠在接种粪便悬液之后，在接种后的前2 d内表现出精神不振，但之后的未再出现明显的临床症状。血清抗体最早于感染后的第21天转为阳性，可持续到感染后第50天（表 2）。

2.3 人工感染长爪沙鼠的HEV正链RNA RT-PCR检测

感染后第7天可从血液、心、肾脏、脾脏、肠系膜淋巴结、肝脏、肺等脏器或粪便中检测到HEV正链RNA，最长的可持续到感染后第50天（图 1和表 3）。

2.4 人工感染长爪沙鼠的HEV负链RNA RT-PCR检测

感染长爪沙鼠的负链RNA RT-n-PCR检测结果见图 2和表 4。

2.5 病理组织学观察

观察发现大部分脏器组织中缺少典型的病理变化。而肝脏的主要病变为广泛肝细胞变性、空泡变性、浊肿、水样变性而致气球样变，肝细胞胞浆疏松、空泡变性、胞核大小不等，出现双核、肝窦扩张或变窄，病理符合小叶性肝炎（图 3）。

2.6 免疫组织化学观察

免疫组织化学观察可见在细胞质中有HEVAg大量分布，细胞核与周围边的细胞界限清晰可见（图 4）。

3 讨论

目前，可实验感染HEV的动物主要有非人灵长类动物和猪，其中以非人灵长类动物最为常用^[14]。自1983年Balayan等^[12]首次使用戊肝患者的粪便提取物成功感染2只猕猴以来，许多非人灵长类动物模型（黑猩猩、恒河猴、枭猴、短尾猴、小绢猴、非洲绿猴等）逐步的建立了起来，其中较为常用的还是猕猴模型。猪作为基因Ⅲ型、Ⅳ型的自然宿主，也可应用于HEV感染的研究。1990年Balayan等^[15]首次用1株亚洲人HEV成功感染猪，实现了HEV猪模型的制作。然而以非人灵长类动物或猪作为实验动物模型具有繁殖周期长、饲养管理繁、价格昂贵及来源有限等缺点^[16]。

长爪沙鼠因其独特的生物学特性在病毒学领域、细菌学领域及寄生虫学领域中应用广泛。如在病毒学领域方面，广泛应用于肾综合征出血热^[17]、流行性出血热病毒^[18]和乙型肝炎病毒^[19]等研究。说明，其在研究人类疾病及新药开发领域具有重要的价值。

本研究首先将HEV阳性猪粪便稀释悬液接种于长爪沙鼠，并每周采集血清和多种组织（心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、脾脏、小肠、回肠、直肠），随后通过ELISA和RT-PCR、免疫组织化学及病理组织学观察进行了感染后检测。

结果发现长爪沙鼠不仅可感染HEV，并且能产生HEV抗体，并且在血液、心、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠系膜淋巴结、粪便中检测到了HEV RNA。再通过对负链RNA的检测，发现在肝、脾、肺、肠系膜淋巴结中存在HEV负链RNA，进而表明HEV可以在以上组织中进行复制，其中病毒在肝脏中残留时间最久。Kasorn-dorkbua等^[20]用HEV阳性样品接种至SPF猪体内，结果发现直接接种在心、胰组织的SPF猪未感染HEV，而直接接种在肝组织的SPF猪成功感染HEV，表明猪体内肝脏是HEV复制的主要器官；Lee等^[21]使用原位杂交技术检测机体内不同组织中的HEV RNA，结果发现存在于肝脏部位的HEV RNA杂交信号最强。以上研究结果与本研究结果均说明肝脏是HEV复制的主要器官部位^[22]。

在接种后的前2天内长爪沙鼠表现出了精神不振等症状，但之后的未再出现较为明显的临床症状，这与赵素元等^[23]使用子午沙鼠作为HEV动物模型的结果相似，说明啮齿类动物模型在具有可大量用于实验，以降低偶然因素带来的影响，增加实验数据的稳定性和可靠性等优势之外，在临床表现方面还存在一些不足之处。但在HEV免疫组化染色发现，细胞质中有大量戊型肝炎病毒抗原（HEV-Ag）的分布，同时在组织病理学观察发现，除肝脏之外大部分脏器组织中缺少典型的病理变化，肝脏的主要病变为广泛肝细胞变性、空泡变性、浊肿、水样变性而致气球样变，肝细胞胞浆疏松、空泡变性、胞核大小不等，出现双核、肝窦扩张或变窄，病理现象均与小叶性肝炎相符合。有研究表明，在发展中国家大约有一半HEV感染患者表现出急性肝炎的症状^[24]，病理学观察可发现肝细胞排列紊乱、汇管区有多形核细胞和淋巴细胞浸润等现象^[25]。Ji等^[26]用Ⅳ型猪HEV通过静脉注射感染猕猴后，肝组织病理学检查后发现，肝细胞有轻到中度水肿、肝门周围存在淋巴细胞浸润等与人急性肝炎病理学现象相似的病变。说明长爪沙鼠在感染HEV后所显示的病变与人及非灵长类动物具有一定的相似性，这一结果说明长爪沙鼠具备作为HEV动物模型的潜在价值。我们有必要进一步对最佳接种途径、时间、环境及对不同基因型HEV的易感性、系统比较病理学观察等进行研究。长爪沙鼠HEV感染模型的建立，将为今后的HEV研究提供一种更为理想的途径，加速HEV的研究进程。

4 结论

本实验探索了使用长爪沙鼠作为HEV感染模型的可行性。通过实验发现，长爪沙鼠具有可感染HEV及体内复制病毒的能力，同时还发现其组织病理学特征与人类具有相似性，说明其具有作为HEV动物模型的潜在价值。