2. 遵义医学院细胞生物学教研室，遵义 563000
2. Department of Cellular Biology, Zunyi Medical University, Zunyi 563000
随着基因工程技术的不断发展，利用植物表达系统生产药用蛋白已成为现代生物技术产业的研究热点[1-3]。植物生物反应器由于具有操作简便、产物活性高、成本低、易扩大规模等优点，在细胞因子、生长因子、抗体及疫苗等药用蛋白表达生产领域获得了广泛的研究和应用[1]。人白细胞介素-12（hIL-12）是由单核细胞、巨噬细胞分泌的一种约为75 kD的糖蛋白细胞因子，由1个约35 kD的小亚基和1个约40 kD的大亚基通过二硫键连接[4]。hIL-12的生物学功能包括：增强细胞毒性反应，诱导INF-γ、IL-2及肿瘤坏死因子TNF-α的生成，以及抗血管生成和抗肿瘤效应等，在先天免疫和适应性免疫过程中起着关键作用[4-6]，在临床上将有着广阔的应用前景和巨大的应用价值。
利用植物生物反应器高效表达生产hIL-12，降低hIL-12的生产成本，具有潜在的应用价值。但是，相比微生物等表达系统的高效性，植物表达系统由于外源蛋白表达量相对较低，限制了发展[7]。对植物表达系统中驱动外源基因的启动子进行优化，如选择植物自身的组织特异性强启动子等，是提高外源基因表达量的常用手段之一[8, 9]。在本论文的前期研究中，克隆了马铃薯块茎特异性的高效启动子Ppatatin并构建其驱动的hIL-12植物表达载体[10]。本研究将前期构建的载体通过农杆菌介导转化马铃薯，旨在获得阳性转基因植株，以期为下一步利用马铃薯高效表达生产hIL-12蛋白奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料本研究用马铃薯材料中薯1号，农杆菌菌株EHA105及表达载体均为本实验室保存
1.2 方法 1.2.1 表达载体导入根瘤农杆菌将-80℃保存的农杆菌菌株EHA105取出活化并接种培养至OD600=0.5，5 000 r/min离心5 min后去除培养基。向菌体加入预冷的0.1 mol/L CaCl2（含10%甘油）洗涤两次后置于冰上。将0.1 mL 细胞与10 ng质粒DNA混匀后冰浴30 min，-70℃放置10 min，42℃水浴热激1 min，最后冰浴2 min，加入800 mL YM液体培养基，175 r/min 28℃摇床培养2 h后取少量涂在含25 μg/mL卡那霉素+利福平的LB平板上，28℃培养2 d。挑取单菌落至LB液体培养基培养后，提取质粒，利用前期工作中启动子克隆时所用的引物[10] Ppatatin-f 5´-TGCGTATTAGTTTTAGCGACGA-3´和Ppatatin-r 5´-GTTGGTGCTTTGAGCATATAAC-3´引物进行PCR鉴定。
1.2.2 马铃薯遗传转化马铃薯遗传转化参照文献[11]并加以改进。将阳性重组农杆菌于28℃振荡培养过夜，菌体离心沉淀后用适量MS液体培养基重新悬浮。将马铃薯无菌苗置于22℃光照8 h黑暗16 h的人工气候箱中进行试管薯诱导，2-3个月后将生长至直径约0.5 cm的试管薯取出，倒入MS液体培养基浸泡20 min。用刀片将薯球横切至1-2 mm左右厚的薄片，置于菌液中轻微摇动5-10 min后，取出薄片，吸干菌液，转入共培养基上（MS+AS 50 mg/L）培养2 d。培养后将薯片转至筛选分化培养基上（MS+100 μg/mL卡那霉素+ 500 μg/mL羧苄青霉素+5 μmol/L IAA）在22℃光照16 h黑暗8 h的条件下培养，待分化出苗后转移至MS培养基上进行生根壮苗和移栽。
1.2.3 基因组DNA提取与PCR鉴定参照文献[12]的方法提取马铃薯叶片基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用引物npt-F：5´-TATTCGGCTA-TGACTGGGCAC-3´和npt-R：5´-GTCGATGAATCCA-GAAAAGCG-3´进行扩增。反应体系为：20 ng模板、2 μL 10×PCR buffer、0.5 μL dNTPs（10 mmol/L）、0.5 μL引物（10 μmol/L）、1 U Taq酶，并补水至20 μL。PCR扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃充分延伸5 min。
1.2.4 RT-PCR分析切取马铃薯幼苗叶片或块茎置于2 mL离心管，加入500 μL GUS染色液（北京奥博莱），37℃避光染色24 h后，将叶片置于1.5 mL 75%乙醇中常温脱色24 h，拍照保存染色结果。用植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN）提取马铃薯块茎总RNA后进行反转录获得cDNA。反转录体系和过程如下：总RNA 2 μg，oligo（dT）（100 ng/μL）1 μL，5×buffer 4 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，RNase inhibitor 20 U，反转录酶M-MLV（北京博迈德）1 μL，加DEPC处理水至20 μL，42℃反应1 h后，-20℃保存备用。以cDNA为模板，以启动子引物Ppatatin-f和Ppatatin-r检测确定有无基因组DNA污染，以hIL-12-F：5´-GCTGATGGATCCTAAGAGGC-3´和hIL-12-R：5´-TTAGGAAGCATTCAGATAGC-3´为引物进行扩增检测hIL-12基因的表达。以组成型基因GAPDH 作为内参，扩增引物为GAPDH-F：5´-ATGAAGGACTGGAGAGGTGG-3´和GAPDH-R：5´-GAAAATGCTTGACCTGCTGT-3´。PCR扩增程序为：预变性94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，26-30循环；72℃延伸10 min。
1.2.5 ELISA分析切取马铃薯块茎约0.5 g，加入3 mL可溶性蛋白提取液（0.1 mol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，1%蛋白酶抑制剂），冰上研磨至匀浆，12 000 r/min离心10 min，上清液即为可溶性蛋白提取液。利用BCA法测定蛋白质浓度，将待测样品稀释50倍后用人IL-12 Elisa检测试剂盒（上海生工）测定样品中hIL-12的含量，按照试剂盒说明书进行操作。主要步骤包括将蛋白质样品（包括标准品与待测样）、生物素标记抗体及酶试剂加入hIL-12包被的酶标板，混匀后37℃保温1 h，洗板后加入显色液，5 min后加入终止液于520 nm测量OD值。
2 结果 2.1 马铃薯遗传转化将前期构建的马铃薯块茎特异性启动子Ppatatin驱动的hIL-12表达载体转化根瘤农杆菌EHA105，挑选5个转化后的单菌落重组子提取质粒并进行PCR鉴定。结果显示，所挑取的5个转化子均能提取出质粒（图 1-A），且均能扩增出大小为1 000 bp的Ppatatin启动子条带，表明表达载体成功导入农杆菌。接着，以马铃薯无菌薯球为外植体（图 1-B），用刀片将其切至1-2 mm厚度薯片后，置于含表达载体的农杆菌菌液中进行侵染，共培养2 d后转至筛选分化培养基。结果（图 1-C）显示，大部分侵染后的外植体在筛选分化培养基上生长良好，在培养约一周后开始出现绿点，2-3周左右长出再生芽。
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| 图 1 农杆菌质粒鉴定及马铃薯遗传转化阶段图 A：表达载体转化农杆菌后的质粒提取电泳图，M：DNA marker，1-5 ：不同单克隆；B：农杆菌质粒PCR 检测电泳图，0：空质粒PCR 结果（阴性对照），其余编号与A 对应；C：马铃薯试管薯；D：农杆菌侵染后的外植体在筛选分化阶段的生长 |
将筛选分化培养基上长出的马铃薯再生芽转至MS培养基继续培养，3-4 周后幼苗长至7-8 cm高度（图 2-A），共得到12个独立的转化再生单株。从转化再生植株幼苗的叶片提取基因组DNA，以npt-F和npt-R为引物扩增卡那霉素抗性基因，检测转基因植株的阳性率。结果（图 2-B）显示，在12株转化再生的植株中，有10株能扩增出大小约为600 bp的卡那霉素抗性基因片段条带，表明为阳性，转基因阳性率为83%。由于导入的表达载体T-DNA区还含有CaMV35S启动子驱动的GUS基因[9]，因此本研究首先利用GUS染色检测外源基因在阳性转基因马铃薯中的表达情况。切取10株阳性植株的幼苗叶片，放入GUS染液中37℃染色24 h后用75%酒精脱色。结果（图 2-C）显示，这10株阳性植株叶片有7株染色成功，进一步表明表达载体已导入马铃薯基因组且报告基因在这7株马铃薯植株中获得了表达。
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| 图 2 马铃薯转基因植株培养与阳性检测图 A：马铃薯转基因幼苗在MS培养基上的生长图；B：马铃薯转基因植株PCR检测电泳图，0：野生型植株叶片（阴性对照），M：DNA marker；1-12：不同的转基因单株编号，下同；C：马铃薯转基因阳性植株叶片GUS染色图 |
将所获得的7株表达了外源基因的马铃薯幼苗取出炼苗3 d，种植在温室中3个月左右后获得转基因马铃薯块茎。首先选取每株植株的1个块茎进行GUS染色和RT-PCR分析，检测外源基因的表达情况。结果（图 3-A）显示，7株阳性植株的块茎均能很明显的染色，初步表明外源基因在这7株马铃薯植株块茎中获得了表达。提取这7株马铃薯植株块茎RNA并反转录成cDNA。首先利用启动子DNA引物Ppatatin-f和Ppatatin-r检测确定无基因组DNA污染后，利用RT-PCR检测hIL-12基因的表达情况。结果（图 3-B）显示，与GUS染色结果一致，hIL-12基因在这7株马铃薯植株均有明显的表达。为进一步确定外源基因在转录后的蛋白质表达情况，提取7株马铃薯块茎总蛋白，利用hIL-12抗体进行ELISA检测，结果（图 3-C）显示，7株马铃薯植株中，3、8、9、10、11号植株块茎中有明显的hIL-12蛋白表达，其中，3号植株的马铃薯块茎hIL-12表达量最高，达到3.74 μg/g可溶性蛋白。最后，为检测外源基因在一株植株所有后代中表达的一致性，选取表达量最高的3号植株的所有8个马铃薯薯球进行GUS染色和RT-PCR分析，结果（图 3-D、3-E）显示GUS基因和hIL-12基因在3号植株的所有8个块茎均有明显的表达。
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| 图 3 hIL-12 基因在转基因马铃薯块茎中的表达检测图 A：马铃薯块茎GUS染色图，0：野生型植株块茎（阴性对照），其余编号表示不同阳性单株块茎；B： RT-PCR检测hIL-12基因在转基因马铃薯中的表达情况图，编号与A对应；C：ELISA检测hIL-12蛋白在转基因马铃薯中的表达，编号与A对应；D：3号转基因植株所有薯球的GUS染色图，0：野生型植株块茎（阴性对照），其余编号表示3号转基因植株所结的不同薯球；E：RT-PCR检测hIL-12基因在7号转基因植株所有薯球中的表达情况图，编号与C对应 |
选取7个转基因单株后代的一部分薯球进行繁殖，取一片每个株系后代的幼苗叶片，放入GUS染液中进行染色分析，结果（图 4）显示所有的叶片均能着色，表明转基因植株在一次无性繁殖后，外源基因的表达稳定。
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| 图 4 GUS 染色法检测第二代马铃薯转基因植株外源基因的表达 0：野生型植株叶片（阴性对照），其余编号表示不同阳性单株后代 |
利用外源重组表达系统生产的生物技术药物已在癌症、心脑血管疾病、糖尿病等重大疾病的治疗方面起着举足轻重的作用[13]。目前大多数的生物技术药物都是以微生物或者动物细胞系进行表达和生产[14-17]。对于白细胞介素这一类的糖蛋白，大肠杆菌系统由于缺乏糖基化等翻译后修饰，对其生物学活性有很大影响，某些产品在商品化前往往需要额外的处理，生产成本增大。而动物细胞系由于操作麻烦，细胞培养条件苛刻且培养费用高，也不是生产重组白细胞介素的理想表达系统[1, 18]。因此，科学家们一直在寻找一种低成本同时又高效的表达系统来生产白细胞介素及其它药用蛋白。自1998年Magnuson等[19]首次报道用烟草悬浮细胞表达了具有活性的人IL-2和IL-4以来，现已有多种白细胞介素先后在植物中成功表达。由于植物细胞具有和哺乳动物细胞相似的转录、翻译及翻译后加工修饰系统，所以植物系统表达的重组白细胞介素一般能进行正确的折叠及二聚化、糖基化等修饰，更易具有生物学活性[20, 21]。而马铃薯由于具有遗传转化体系完善、转化周期较短、无性繁殖技术成熟、生长容易产量高等优势，被广泛用来进行药用蛋白表达研究[1, 9, 22-24]。
但是，相比于商业化的生物反应器的高效性，植物生物反应器的外源蛋白表达量较低。Gutie´rrez-Ortega 等[25]早在2004年便在烟草中成功表达了具有生物学活性的hIL-12蛋白，但表达量仅为30 ng/g鲜重；在本实验室的前期研究中，利用组成型的CaMV35S启动子驱动hIL-12基因在马铃薯中表达，获得了具有生物学活性的重组蛋白，但表达量非常低[26, 27]。因此，如何提高外源蛋白在植物中的表达量引起不少研究者的关注。常用的手段包括：利用植物自身的组织特异性强启动子驱动外源基因[9]；将外源蛋白带上不同亚细胞定位的标签增加其表达等[24]。如：Park等[9]利用Ppatatin启动子驱动IL-2的表达，表达量得到大大提高；而Ma等[24]则在需要表达的IL-4基因后融合细胞质定位的KDEL标签，也达到了提高表达量的目的。在本论文前期研究中选择的Ppatatin启动子，其下游基因表达产物是一类分子量约为40 kD的糖蛋白，其在马铃薯块茎可溶性总蛋白中的含量高达40%，而在其它组织中的含量极少[28]，因此该启动子是马铃薯块茎组织中高效特异启动子。本研究选用前期构建好的表达载体[9]，利用农杆菌介导的方式，将表达载体转入马铃薯细胞中，得到了10个阳性转基因马铃薯株系。RT-PCR分析结果显示10个阳性株系中的7个株系成功在转录水平表达了hIL-12基因。ELISA分析表明，其中5个株系在蛋白水平有大量的表达，在每克可溶性蛋白中重组蛋白的表达量最高可达到3.7 μg。另外，还有两个株系在RNA水平检测到了hIL-12表达但在蛋白水平的表达不明显，可能是由于外源mRNA表达量较低影响了外源基因的翻译，现已和其它株系一并种植并拟对其下一代进一步进行检测。此外，3号植株的所有8个马铃薯薯球均能检测到外源基因的表达，初步表明同一株植株的所有块茎中，外源基因的表达具有一致性。
植物基因组遗传的复杂性，外源基因在转基因植物中的遗传稳定性颇受关注，而药用蛋白基因的遗传稳定性是影响植物生物反应器生产效率的决定因素之一[7]。由于马铃薯的繁殖方式以无性繁殖为主，因此选择马铃薯作为生物反应器也可以在一定程度上避免因有性繁殖带来的遗传稳定性问题。为验证本研究实验材料的遗传稳定性，利用GUS染色对无性繁殖的第二代植株的外源基因表达情况进行了检测。结果显示，所检测的所有材料均能明显染色，初步表明本研究的外源基因在马铃薯植株中具有非常好的遗传稳定性。
4 结论本研究利用农杆菌介导的遗传转化方式获得了转hIL-12基因的阳性马铃薯植株，GUS染色、RT-PCR分析和ELISA分析均表明大部分植株中均有外源基因的表达，且经过一次繁殖后其表达稳定。
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