2. 中国科学院北京基因组研究所，北京 100101
2. Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101
磷脂酰肌醇蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素糖蛋白中的一个家族，参与调控个体发育、细胞增殖和分化等过程[1-3]。有研究表明，Glypican-3与多种肿瘤的发生发展关系密切，特别是在肝细胞癌中特异性高表达，是一种潜在的肝癌血清学和组织学重要诊断标志物[4-12]。另外，近期的研究表明GPC3不但能够用于肝癌的诊断，而且具有抑制肝癌细胞系生长的功能[13]，该发现为肝癌的特异性治疗提供了新的思路。
本研究利用真核表达载体和脂质体转染技术，获得了稳定表达Glypican-3的单克隆细胞系。通过大量培养、细胞破碎和亲和纯化，获得了一定数量的GPC3蛋白，为进一步研究GPC3的分子生物学特性和功能奠定了良好的基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞、菌株与质粒含GPC3基因的质粒由德国洪堡大学病理学研究所Lage博士惠赠；克隆菌株E.coli DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；克隆载体pMD18-T购自宝生物公司；人胚胎肾细胞HEK293购自国家实验细胞共享平台；表达载体p3XFLAG-CMV-14购自Sigma公司。
1.1.2 主要试剂限制性内切酶EcoRΙ和BamHΙ、T4连接酶、Pfu DNA聚合酶均购自New England Bio-labs公司；DNA分子质量标准和凝胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；蛋白质分子量标准购自美国热电公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Life公司；ANTI-FLAG® M1 Agarose Affinity Gel及ANTI-FLAG抗体购自Sigma公司；兔抗人GPC3蛋白和兔抗人β-actin抗体购自美国ABcom公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG抗体购自北京华美公司；细胞培养板、DMEM培养基，胎牛血清，均购自美国GIBCO公司。
1.2 方法 1.2.1 目的基因的克隆根据GPC3的基因阅读框序列设计扩增引物，上游引物：5'-CGGAATTCCTT-GGTGGTGGCGATGCT-3'（下划线部分为EcoR Ι酶切位点）；下游引物：5'-CGGGATCCCCCGAGGTTG-TGAAAGGT-3'（下划线部分为BamH Ι酶切位点）。使用上述引物，以含GPC3基因的质粒为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃延伸15 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 重组质粒pMD18-gpc3的构建及鉴定将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，连入pMD18-T载体，产物用T4连接酶在16℃水浴中连接。将连接产物转化至E.coli DH5α菌株，筛选阳性克隆，获得重组表达质粒pMD18-gpc3。
1.2.3 重组质粒pCMV-gpc3的构建及鉴定将质粒pMD18-gpc3和质粒p3XFLAG-CMV-14分别用EcoR Ι和BamH Ι双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。取含有酶切位点的目的基因和经双酶切的p3XFLAG-CMV-14用T4连接酶在16℃水浴中连接。将连接产物转化至E.coli DH5α菌株，筛选阳性克隆，获得重组表达质粒pCMV-gpc3。
1.2.4 HEK293细胞的培养HEK293细胞培养于37℃、5% CO2培养箱中，培养基为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。待细胞密度达到90%时，用0.05%胰蛋白酶进行消化传代，传代比例为1∶3。
1.2.5 重组质粒转染将状态良好的HEK293细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板中，继续培养，待细胞密度达到80%-90%时进行转染。用PBS冲洗3次，加入无血清DMEM高糖培养基。按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行，转染时设立阴性组（p3XFLAG-CMV-14）和阳性组（pCMV-gpc3质粒）。细胞转染48 h后用含有0.5 mg/L G418、10%胎牛血清的DMEM高糖培养基加压筛选，采用有限稀释法原理将细胞转至96孔板，每孔1-2个细胞。待96孔板内细胞增殖成团后，传至细胞培养瓶继续培养，最终得到稳定表达重组蛋白的单克隆细胞株pCMV-gpc3/293和阴性对照组pCMV-gpc3/NC。
1.2.6 Westernblot检测转染后GPC3蛋白表达水平 待稳定表达重组蛋白的细胞株和HEK293细胞生长至密度约90%时，收集细胞，裂解细胞提取细胞总蛋白，提取方法按照试剂盒说明书进行。BCA法测定蛋白浓度后，取适量蛋白进行SDS-PAGE电泳，参照文献[14]的方法进行。
电泳结束后以恒压90 V，利用半干转移设备将蛋白转移至PVDF膜上；将转好的膜浸入封闭液（含5%（M/V）脱脂奶粉的TBST中，室温轻摇封闭2 h；以购买的兔抗人GPC3蛋白抗体、兔抗人β-actin和ANTI-FLAG抗体为一抗，用封闭液按1∶1 000稀释，室温轻摇孵育2 h；TBST洗膜4次，每次孵育10 min；以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，用封闭液按1∶10 000稀释，室温轻摇孵育1 h；TBST洗膜4次，每次孵育10 min；ECL发光显色系统显色。
1.2.7 重组蛋白的分离纯化及验证大量培养筛选到的单克隆细胞，参照文献[14]的方法对细胞进行破碎，低温离心取上清液按照ANTI-FLAG® M1 Agarose Affinity Gel试剂盒说明书进行纯化。采用超滤的方法浓缩重组蛋白，取适量蛋白进行SDS-PAGE电泳，Western blot检测重组蛋白。
2 结果 2.1 GPC3基因的扩增用PCR方法进行扩增。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，其中以无菌水为模板的阴性对照组没有出现扩增条带，而以含GPC3基因的质粒为模板，扩增到了一条长1 650 bp的片段，结果（图 1）与预期大小相一致。
|
| 图 1 GPC3基因PCR扩增结果 M：3 000 bp DNA分子量标准；1：阴性对照；2：GPC3基因PCR产物 |
构建的重组质粒pMD18-gpc3和表达质粒pCMV-gpc3进行EcoR Ι和BamH Ι双酶切，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图 2）与预期大小相一致。质粒pCMV-gpc3经测序鉴定，测序结果表明插入片段与GenBank中公布的全序列中该片段完全一致，且以正确的方向插入到表达载体的克隆位点，真核表达载体质粒pCMV-gpc3构建成功。
|
| 图 2 重组质粒酶切鉴定结果 M：10 000 bp DNA 分子量标准；1：重组质粒pMD18-gpc3；2：重组质粒pMD18-gpc3的EcoRΙ和BamHΙ双酶切产物；3；重组质粒pCMV-gpc3；4：重组质粒pCMV-gpc3的EcoRΙ和BamHΙ双酶切产物 |
以购买商业化兔抗GPC3多抗、兔抗人β-actin多抗和ANTI-FLAG抗体为一抗，进行Western blot分析鉴定，结果见图 3。在阳性细胞株pCMV-gpc3/293的总蛋白提取液中，无论是用兔抗GPC3多抗还是兔抗FLAG多抗，结果中都可以看到在65 kD左右的位置上有带，而阴性细胞株pCMV-gpc3/NC总蛋白则没有任何显色带出现，表明阳性细胞株pCMV-gpc3/293成功表达出GPC3蛋白。同时作为参照，阳性细胞株和阴性细胞株的β-actin蛋白表达基本一致。
|
| 图 3 GPC3蛋白表达Western blot分析 1：阴性组 pCMV-gpc3/NC（一抗为兔抗FLAG多抗）；2：阴性组 pCMV-gpc3/NC（一抗为兔抗GPC3多抗）；3：阳性组 pCMV-gpc3/293（一抗为兔抗FLAG多抗）；4：阳性组 pCMV-gpc3/293（一抗为兔抗GPC3多抗） |
将经过纯化及浓缩的重组蛋白及细胞破碎产物进行SDS-PAGE电泳，结果见图 4。由于真核细胞表达外源蛋白的水平较低，为了获得一定量的重组蛋白，本研究大量培养细胞，从1014个细胞中提取纯化到0.1 mg重组蛋白，鉴于得率太低，研究组计划优化培养条件，以获得更高的得率和重组蛋白。从图 4中可以看出，经过纯化及浓缩后，得到了一个分子量约为65 kD的蛋白条带，与Western blot检测一致（图 5）。
|
| 图 4 纯化后GPC3蛋白SDS-PAGE电泳分析 M：蛋白质分子量标准；1：细胞总蛋白；2：经亲和柱纯化后产物 |
|
| 图 5 纯化后GPC3蛋白Western blot分析 M：蛋白质分子量标准；1：纯化浓缩后重组GPC3蛋白 |
目前，我国恶性肿瘤已经排在居民主要疾病死亡率的首位，成为影响人们健康的头号杀手。统计数据表明2010年全国恶性肿瘤发病率为235.23/10万。其中，肝癌（特别是原发性肝细胞癌）的死亡率仅次于胃癌，已经成为我国的第二大癌症[15]。发现并确定新的肝癌早期诊断、治疗靶点具有重要的科学意义和临床价值[16, 17]。最近，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作为一种新的肝癌肿瘤标志物被国内外研究人员提出。研究人员发现GPC3在多个肿瘤组织中特异表达，特别是在肝癌中的特异性高表达，使我们看到了其成为继AFP后又一个肝癌肿瘤标志物的前景。
Shirakawa等[18]利用免疫组化的方法对3种原发性肝癌（hepatocellular carcinoma HCC，intrahepatic cholangiocarcinoma ICC，combined hepatocellular and cholangiocarcinoma CHC）组织中的GPC3蛋白表达情况进行了分析，发现ICC病例组织中不表达GPC3蛋白，CHC病例中部分表达GPC3蛋白，而在HCC病例组织中大量表达78.3%（36/46），所以作者最终得出GPC3蛋白对于HCC具有特异性的结论。付顺军等[19]利用酶联免疫和化学发光的方法，对健康者、肝硬化患者和肝癌确诊病例血清中的GPC3和AFP含量进行了测定，发现健康者和肝硬化患者血清中的GPC3浓度无统计学差异。而肝癌患者血清中的GPC3浓度与健康者和肝硬化患者血清有显著的差异，表明GPC3对肝癌有较高的敏感性和特异性。当GPC3以3 μg/L，AFP以20 μg/L为诊断界限时，GPC3的敏感性要高于AFP。Akutsu等[20]利用商品化的ELISA试剂盒检测血清中的GPC3含量，发现健康者和乙肝患者的含量均低于阈值，HCC患者中有50%（32/64）的含量高于阈值，HCC的平均含量明显高于非HCC。
为了探究GPC3与肝癌的关系，获得具有自主知识产品的抗GPC3抗体，进而开发肝癌早期诊断方法，本研究成功构建了真核表达载体pCMV-gpc3。经过脂质体转染，得到能够稳定表达GPC3的细胞株。最终通过高效表达、提取和纯化等过程获得了一定量纯度较好的重组GPC3蛋白。选用真核表达载体p3XFLAG-CMV-14及HEK293细胞宿主是因为GPC3是一个糖蛋白，只有在真核细胞中进行表达，才能够最接近于其天然的状态。目前，已经有多个研究小组利用HEK293细胞无基础性表达GPC3的特性进行GPC3的相关研究[21, 22]，同时p3XFLAG-CMV系统是一种高效的真核表达系统，该系统具有高效的强启动子CMV启动子，有利于目的蛋白的高效表达。并且表达的蛋白中含FLAG标签，利用FLAG亲和纯化层析柱，能够对表达产物进行纯化，且纯度非常高，有利于后续实验的进行。
4 结论本研究成功构建了真核表达载体pCMV-gpc3。经过脂质体转染，得到能够稳定表达GPC3的细胞株。最终通过高效表达、提取和纯化等过程获得了一定量纯度较好的重组GPC3蛋白。
| [1] | Filmus J. Glypicans:proteoglycans with a surprise[J]. Glycobiology, 2001, 11(3): 19–23. |
| [2] | 蒋虹. GLYPICAN-3基因在非小细胞肺癌中的表达与意义[D]. 上海:第二军医大学, 2004. |
| [3] | Pilia G, Hughes-Benzie RM, MacKenzie A, et al. Mutations in GPC3, a glypican gene, cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth syndrome[J]. Nat Genet, 1996, 12(3): 241–247. |
| [4] | Huber R, Crisponi L, Mazzarella R, et al. Analysis of exon/intron structure and 400 kb of genomic sequence surrounding the 5'-promoter and 3'-terminal ends of the human glypican 3(GPC3)gene[J]. Genomics, 1997, 45(1): 48–58. |
| [5] | Huber R, Mazzarella R, Chen CN, et al. Glypican 3 and glypican 4 are juxtaposed in Xq26.1[J]. Gene, 1998, 225(1-2): 9–16. |
| [6] | Veugelers M, De Cat B, Ceulemans H, et al. Glypican-6, a new member of the glypican family of cell surface heparan sulfate proteoglycans[J]. J Biol Chem, 1999, 274(38): 26968–26977. |
| [7] | Nakatsura T, Yoshitake Y, Senju S, et al. Glypican-3, overexpressed specifically in human hepatocellular carcinoma, is a novel tumor marker[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 306: 16–25. |
| [8] | Capurro M, Wanless IR, Sherman M, et al. A novel serum and histochemical marker for hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 2003, 125(1): 89–97. |
| [9] | Shirakawa H, Suzuki H, Shimomura M, et al. Glypican-3 expression is correlated with poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Sci, 2009, 100(8): 1403–1407. |
| [10] | Tangkijvanich P, Chanmee T, Komtong S, et al. Diagnostic role of serum glypican-3 in differentiating hepatocellular carcinoma from non-malignant chronic liver disease and other liver cancers[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2010, 25(1): 129–137. |
| [11] | Filmus J, Capurro M. Glypican-3:a marker and a therapeutic target in hepatocellular carcinoma[J]. FEBS J, 2013, 280(10): 2471–2476. |
| [12] | 程华, 方向东, 吴萌, 等. 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的原核表达及单克隆抗体制备[J]. 生物技术通报, 2014, (3): 177–181. |
| [13] | Feng M Q, Kim H, Phung Y, et al. Recombinant soluble glypican 3 protein inhibits the growth of hepatocellular carcinoma in vitro[J]. Int J Cancer, 2011, 128(9): 2246–2247. |
| [14] | 奥斯伯F, 布伦特R, 颜子颖, 等. 精编分子生物学实验指南[M]. 北京: 科学出版社, 2001. |
| [15] | 陈万青. 2014中国肿瘤登记年报[M]. 北京: 军事医学科学出版社, 2014. |
| [16] | Torre L, Siegel R, Jemal A. Global Cancer Facts & Figures[M]. America: American Cancer Society, Inc, 2015.4-20. |
| [17] | Torre L, Bray F, Siegel R, et al. Global Cancer Statistics, 2012[J]. Ca Cancer J Clin, 2015, 65: 87–108. |
| [18] | Shirakawa H, Kuronuma T, Nishimura Y, et al. Glypican-3 is a useful diagnostic marker for a component of hepatocellular carcinoma in human liver cancer[J]. Int J Oncol, 2009, 34(3): 649–656. |
| [19] | 付顺军, 李绍强, 林杰, 等. 血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白在干细胞癌诊断中的价值[J]. 中华普通外科学文献, 2010, 4(6): 553–556. |
| [20] | Akutsu N, Yamamoto H, Sasaki S, et al. Association of glypican-3 expression with growth signaling molecules in hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2010, 16(28): 3521–3528. |
| [21] | Capurro M, Xiang YY, Lobe C, et al. Glypican-3 promotes the growth of hepatocellular carcinoma by stimulating canonical wnt signaling[J]. Cancer Res, 2005, 65(14): 6245–6254. |
| [22] | Lee YL, Ahn BC, Lee YJ, et al. Targeting of hepatocellular carcinoma with glypican-3-targeting peptide ligand[J]. Journal of Peptide Science, 2011, 17(11): 763–769. |