随着世界人口的增长, 土地和水资源缺乏，全球气候变化，使人们担忧未来全球粮食产量能否满足人们日益增长的粮食需求。尤其，我国是世界人口最多的国家之一，满足13 亿人口的粮食需求，一直是我国的头等大事。要解决这个问题，除了保持水土和利用传统育种方式提高作物产量和质量外，更需要一种新的快速有效的农业新技术。转基因技术是现代生物技术的核心，运用转基因技术培育高产、优质、多抗、高效的新品种，降低农药、肥料投入，对缓解资源约束，保护生态环境、改善产品品质、拓展农业功能等具有重要作用。目前，世界许多国家都把转基因生物技术作为支撑发展、引领未来的战略选择，转基因技术已成为各国抢占科技制高点和增强农业国际竞争力的战略重点[1]。
MicroRNA（miRNA） 是生物体内普遍存在的一种内源、非编码、长度约21-25 个核苷酸的小分子单链RNA。在植物中，miRNA 通过与靶ｍ RNA分子不完全互补配对来识别靶基因mRNA，降解靶mRNA 或抑制靶mRNA 的翻译，从而调节靶mRNA的丰度和功能[2]。miRNA 的表达不受翻译过程影响，比蛋白基因更迅速，调控效率更高。同一个miRNA可抑制多个靶基因的功能，同一个靶基因又可被多个miRNA 所调控。miRNA 是1993 年最早发现于线虫中[3]。此后，大量的miRNA 被测序和验证。目前，miRBase（Release 21）数据库中共收录了223个物种的28 645 个前体miRNAs 序列和35 828 个成熟miRNA 序列信息。研究发现，miRNAs 在病原体侵入，环境胁迫响应和植物生长发育等方面发挥着重要的调控作用，为利用基因工程手段进行作物改良提供了丰富的候选基因资源[4, 5, 6, 7, 8]。基于miRNA 的转基因技术可通过增加植物耐受生物和非生物胁迫的能力及增加生物量来发展优质的作物品种，提高边际土地的利用率，减少农药的使用量，促进农业生产力发展[9]。
本文综述了miRNAs 在生物胁迫、非生物胁迫和植物生长发育等方面研究的最新进展，同时分析了miRNAs 介导的基因调控在作物改良中的应用潜能，并介绍了几种主要的基于miRNA 作用机制的植物基因工程应用策略，也讨论了基于miRNA 的转基因技术所面临的风险、挑战。旨在为利用植物基因工程技术改良作物提供理论参考。
1 植物MicroRNA 研究进展植物在生长过程中，不可避免地要耐受各种生物胁迫和非生物胁迫的影响。长期的进化也使植物形成了适应各种胁迫的机制。随着对大量胁迫处理材料小RNA 数据信息的分析和对特定miRNAs 功能鉴定研究数据的积累，植物miRNAs 通过转录后的基因调控，在各种胁迫响应中发挥重要作用的潜在分子机制陆续被揭开。此外，miRNAs 还参与调控植物开花、结实、分蘖等生长发育过程，进而影响植物形态构建和生物产量。近几年，基于miRNA 机制的转基因技术成为新的研究热点，国内外学者都希望从中得到改善作物耐受胁迫能力和提高作物产量的新途径。本部分主要介绍miRNA 介导的基因调控在生物胁迫、非生物胁迫和植物生长发育方面的最新研究进展（表 1）。
目前，miRNA 介导的植物抗生物胁迫相关研究主要集中在通过深度测序和计算机数据分析生物胁迫相关的miRNAs，特定miRNAs 相应各种生物胁迫的相关功能的鉴定仍需进一步深入的研究。但迄今获得的数据可清楚地表明，miRNA 与植物复杂的抗生物胁迫防御机制相关。
植物病菌（病毒、细菌和真菌）感染和病虫害（害虫和线虫）是影响植物生长发育的两个主要的生物胁迫。（1）植物miRNAs 与病毒。在长期的进化过程中，植物形成了一种RNA 沉默（RNA silencing）途径来抵抗病毒侵染。相反，植物病毒通过编码RNA 沉默抑制子（viral suppressors of RNA silencing，VSR）来抵抗寄主的这种防御反应，达到顺利侵染目的。许多证据表明，植物miRNA 与病毒侵染的这种防御过程有关。如miR160、miR166、miR167、miR171 和miR396 家族在水稻响应条叶枯病毒（RSV）感染时被积累[10]。（2）植物miRNAs 与细菌。植物的固有免疫系统依赖于模式识别受体（PRRs）与病原相关模式分子（PAMPs）的相互作用对入侵病原体进行识别，导致PAMP 触发的免疫反应PTI，从而参与免疫调节[11]。miRNA 也是这种防御机制的一部分。拟南芥miR393 就是最早系统报导的通过调节生长素信号转导途径在植物抗丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）等细菌性病中起作用的miRNA[12, 13]。另外，植物进化出NBS-LRR 免疫受体，特异识别在感染过程中注入植物细胞内的病原体效应因子，导致触发免疫反应ETI，作为植物免疫的第二道防线[11]。MicroRNAs 作为一种缓冲调节剂调控着NBS-LRR 类R 基因，使植物在正常生长状态下，NBS-LRR 类基因的转录水平限制在最低水平。当植物（如棉花、番茄等）受到病毒，细菌或真菌等病菌感染时，某些MicroRNAs（如miR482）的表达下调，而其对应的靶基因NBS-LRR 上调，从而调节植物相应疾病[14]。（3）植物miRNAs 与真菌。miRNAs 和植物与根瘤菌的共生固氮作用密切相关。例如，miR171 和 miR397 被鉴定与豆科植物生物固氮过程中的共生感染和结节有关[13]。（4）植物miRNAs 与抗虫。研究表明，在烟草中超表达人工amiR-24，amiR-24 可以靶向作用棉铃虫的几丁质酶基因，使棉铃虫幼虫停止蜕皮而死亡[15]。因此，MicroRNA 介导的基因调控技术具有替代Bt 毒素技术的潜能。（5）植物与线虫感染作用相关。比较分析大豆受大豆胞囊线虫（SCN）感染后的miRNA 表达谱发现，在大豆胞囊线虫抗性品种和易感品种之间，有20 个miRNAs 特异表达[16]。
1.2 植物miRNA与非生物逆境胁迫在植物生长过程中，常会受到来自环境的多种非生物胁迫影响，非生物胁迫包括干旱、盐碱、高低温、氧化、营养缺失、重金属及UV-B 辐射等。植物根据逆境种类及胁迫程度可自身诱导或抑制相应miRNA 表达来调控相关基因表达水平，使植物改变生理状态而适应不同程度的逆境胁迫。目前，不同逆境条件下或相同逆境的不同胁迫程度处理下，已测序和鉴定出了大量与逆境相关的miRNA。2011年，Li 等[17]对干旱、盐、碱胁迫下的大豆幼苗进行小RNA 高通量测序，71、50 和45 个miRNA 分别在3 种胁迫下特异表达，表明在不同胁迫下有不同的miRNA 被特异诱导表达。2014 年，Li 等[18]首次以芹菜为材料，利用qPCR 对冷和热胁迫下的miR160、miR164、miR168、miR394、miR395 和miR408 共6 个miRNAs 进行分析，结果显示，这6个miRNAs 在短时间内与温度胁迫响应有关。2015年，Panda 等[19]对营养缺失胁迫条件下的miRNA进行了综述，一些植物在磷缺失的土壤基质中可诱导miR399，硫缺失可诱导miR395，铜缺失可诱导miR398、miR397 和miR408。作者推论植物中被营养缺失胁迫诱导的miRNAs 可能参与氧化还原和活性氧信号（ROS）途径。此外，Ultraviolet-B（UV-B）辐射也是影响作物生长和发育的主要因素。Northernblotting 发现在小麦中6 个miRNAs 高度响应UV-B，其中，miR159、miR167a 和miR171 上调，miR156、miR164 和miR395 下调[20]。
1.3 MicroRNA与植物生长发育MicroRNA 在植物生长发育过程中，可参与调控植物分蘖、开花、结实、果粒尺寸等过程，进而影响植物生物产量与生物量。挖掘与水稻产量相关的miRNA 分子，阐明其生物学功能与作用机理，对了解作物产量的遗传调控机制、提高作物产量有重要意义。0smiR397 是第一个被发现能够正调控水稻产量性状的miRNA，在水稻中过表达OsmiR397 可以显著增大种子的体积及千粒重，还能促进穗分支，使每穗粒数显著增多，以及促使开花提前等。研究OsmiR397 增加水稻产量的分子机制发现，OsmiR397是通过切割其靶基因OsLAC 实现功能的[21]。miR397在许多物种中都是高度保守的，这一发现不仅可以为水稻增产提供新的分子生物学方法，而且可以应用到其他物种中。
2 相关miRNA 的转基因应用策略随着高通量测序技术和生物信息学技术的发展，越来越多的植物miRNAs 与其靶基因被预测和验证，植物miRNAs 为利用基因工程手段进行作物改造提供了新的丰富候选基因资源。一些基于miRNA 作用机制的转基因技术也进一步发展并被成功应用于植物品种的改造，为开发优良农艺性状的基因工程作物新品系提供新的技术手段。目前，基于miRNA 与其靶基因作用机制的植物品种改良转基因技术大致分为两种策略（图 1）：（1）当候选miRNA 正向调节目标农艺性状时，可以采用超表达miRNAs 或人工amiRNAs 的方式加强miRNA 对靶基因的调控作用，也可以采用RNAi 直接敲除靶基因的方式，削弱靶基因作用，从而促进期望的优良农艺性状；（2）当候选miRNAs 负向调节目标农艺性状时，可以采用人工Target Mimics 方式吸附miRNA，降低miRNA对其内源靶基因的沉默作用，也可超表达靶基因或miRNA-resistant 靶基因来直接增强靶基因的有效活性，最终促进目标性状。此外，以上转基因技术可灵活配用组成型，胁迫诱导型或组织特异型启动子，从而使以上基因表达在特定时期和特定的组织中实现时空调控，也可通过更换强或弱启动子调控基因表达程度，使以上转基因技术更将合理的运用于改良经济作物的遗传性状。本部分针对基于miRNA 与其靶基因作用机制的几种重要的转基因技术具体介绍如下。
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| 图 1 miRNA 的转基因应用策略 |
RNA 干扰技术（RNAi）是由互补的内源或外源双链RNA（dsRNA）切割而成的反义siRNA 形成的沉默复合体（RISC），降解同源互补mRNA 的现象，RNA 干扰技术可以敲除或沉默某特定基因的表达。当候选miRNA 通过作用的靶基因正向调控目标性状时，通常采用miRNA 的超表达策略增强转基因植物的性能。然而，由于miRNA 的基因多效性（即同一miRNA 可靶向负调控多种mRNA）会导致非目的靶基因被同时调控，而造成负面影响。因此，此时可采用RNAi 干扰技术操纵特定miRNA 靶基因的沉默来避免miRNA 超表达导致的边缘效应影响。例如，在水稻中下调两个miR319 靶标基因OsPCF5 和OsPCF8 中任意一个表达的RNAi 植株，都导致低温驯化后冷抗性的增强[33]。
2.2 amiRNAsamiRNAs（artificial microRNAs） 是模拟内源miRNA 的生成途径人工设计合成的miRNA。amiRNA 技术的原理就是将内源pre-miRNA 序列中的miRNA ：miRNA* 置换为人工设计好的amiRNA ：amiRNA* 转化到植物中，形成的pre-amiRNA 在植物体内按照内源miRNA 的生物合成途径可产生成熟的amiRNAs，从而介导靶基因的沉默表达。amiRNA 技术可针对同一基因的不同靶位点设计多个amiRNA干扰载体，以此增强基因的沉默效率；也可针对多个基因构建多个amiRNA 串联的表达载体，实现多基因的同时沉默。WMD3（http://wmd3.weigelworld.org/）设计平台即可实现植物amiRNA 序列，载体及扩增引物的自动化设计。近期研究发现，转基因衍生或病毒诱导的siRNA 能通过植物大分子运输系统扩散到其他组织，因此可能会对正常植物组织和器官造成损伤，而amiRNAs 却很少有非期望的沉默信号的传播发生，具有较高的生物安全性[54, 55, 56]。此外，siRNAs 不仅靶向候选的RNA，也影响那些不能精确互补的RNA（脱靶效应），而amiRNAs 设计可选择与靶mRNA 序列作用特异性高的序列，提高作用的精准性[57]。因而，amiRNA 可能成为作物改良的最有效工具之一，具有广阔的应用前景。目前，amiRNA 技术已被成功应用于水稻[58]，马铃薯[59]、棉花[60]及烟草[61]等多种作物的抗病毒品种培育研究中。在实际生产中，作物常常遭遇多种病毒联合侵染，传统的RNAi 干扰技术只能使作物抵抗部分病毒株系，无法培育获得具有持久广谱病毒抗性的作物。amiRNA 与靶mRNA 之间允许存在一定数量的错配碱基，针对病毒基因组保守区设计amiRNA，能使转基因作物有效抵抗大多数病毒株系，并且即使病毒基因发生了突变也依然保持对该病毒的抗性。
2.3 MiRNA Target Mimics（TM）在miRNAs 负调控目标农艺性状时，抑制miRNAs 的表达或上调它们的靶基因是改良作物的有效策略，采用的手段分别是超表达MiRNA TargetMimics（TM）和超表达抗miRNA 作用的同义突变靶基因。MiRNA Target Mimics 是一种调节內源特定miRNA 丰度的miRNA 缺失技术。具体方法是通过超表达mimicry RNA，使其吸附大量与其互补配对的成熟miRNA，降低miRNA 与其相应靶mRNA 的结合机会，从而阻止miRNA 对其内源靶基因的沉默作用。针对不同miRNA 家族成员形成的成熟miRNA，设计相应的Target Mimics，可以对miRNA 特定家族成员进行抑制沉默，也可用来沉默整个miRNA 家族成员[62]。Target Mimics 的作用最早是在研究Pi 平衡时被发现的。植物在缺磷胁迫下，miR399 被诱导降解靶基因PHO2，PHO2 编码的E2 泛素相关结合蛋白能够影响植物中磷的含量及磷的再利用过程[63]。还发现IPS1 家族基因在缺磷条件下被诱导产生，其可通过保守区的互补序列与miR399 互补结合，占据miR399，却不被降解，从而减少了miR399 与靶基因PHO2 的结合，影响miR399 调节PHO2 基因的能力[64]。在拟南芥中，miR165/miR166 调控的REVALUTA（REV）基因是顶端分生组织的一个关键调节因子，该基因的突变将影响植株的侧枝数量，是分支性状的一个正调控因子。MIM165/MIM166可吸附miR165/miR166 而不被降解，增加靶基因REVALUTA（REV）的作用[65]。如果这种作用被应用到单子叶植物的分蘖，可提高作物产量而获得农业收益。
Target Mimics 植株对研究miRNA 功能提供了一个很好的研究材料和手段。Target Mimics 作为调节內源miRNAs 水平的一项新技术可应用于改良农业性状和提高作物产量。然而，需要明确的是TargetMimics 对某一miRNA 的限制作用，会导致miRNA对应所有靶基因的水平提高，而不是特定的某一目的靶基因[54]。并且內源Target Mimics 是否仅限于非编码区尚不明确。所以，应用这项技术面临挑战。例如，拟南芥miR319 和 miR159 序列相近但属于不同的miRNA 家族，它们的靶基因分别是TCP 和MYB 基因。在MIM319 和 MIM159 植株中，miR159和miR319 表达水平均减少，相应MYB 和TCP 表达水平均提高，说明两种Target Mimics 产生了意外的交叉脱靶效应，对序列相近的miR159 和miR319 同时产生了抑制作用[66]。
另外，已经证实通过miRNA 基因缺失来研究microRNA 基因的功能是很难的，因为大多数miRNA 家族具有遗传冗繁性[67]。利用miRNA 诱捕技术，如target MIMICs（MIMs）、short tandem targetMIMICs（STTMs）和molecular SPONGEs（SPs），可通过影响内源性miRNA 的活性而产生miRNA 功能缺失表型[67]。如cmSP165/166 与 STTM165/166 和MIM165/166 相比表现出较强的效应。MIM159 比cmSP159 与 STTM159 效应强。总之，没有哪一种方法能保证最强的miRNA 抑制，而不同的miRNA 家族对各种方式有不同的反应。建议多种方式相结合，可以获得期望的功能缺失结果[67]。
2.4 超表达miRNA-resistant tagertsmiRNA-resistant tagerts 即抗miRNA 作用的同义突变靶基因，指的是通过改变靶基因与miRNA 互补区的核苷酸序列（不改变氨基酸序列），而打断miRNA 与靶基因之间的序列配对连续性关系，从而得到新的不受內源miRNA 调节的靶基因。在植物中超表达miRNA-resistant tagerts 与直接超表达植物miRNA 的內源靶基因相比，它们翻译产生的蛋白质编码序列不变从而保证了靶基因功能的性质不变，但由于miRNA-resistant tagerts 基因可以避免内源miRNA 的调控影响，因此，miRNA-resistant tagerts可以在转基因植物中积累更高的表达水平，功能更显著。在实际研究中发现，在植物中超表达miRNAresistanttagerts 与超表达MiRNA target mimicry 所展现的表型相似，但和超表达miRNA/amiRNAs 与靶基因RNAi 展现的表型相反。例如，在拟南芥中超表达miR394 和其靶基因LCR 突变体均表现出盐敏感性和抗寒性增强，但超表达抗miR394 作用的同义突变靶基因mLCR，转基因植株则表现出耐盐性增强和抗寒性降低[68, 69]。在水稻中，鲁玉柱等成功克隆出了水稻的OsCSD2 基因，并根据密码子的兼并性，突变了miR398 作用的位点，但不改变其氨基酸序列，得到了新的抗miR398 的OsmCSD2，构建过表达载体并转入水稻中。结果表明，在重金属铜胁迫下，过表达抗miR398 的OsmCSD2 转基因株系表现出良好的抗逆性，H2O2 含量显著低于野生型（图 2）[42]。
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| 图 2 基于miRNA 与其靶基因作用机制的转基因技术 |
转基因技术自诞生时起，争论就从未停息过。基于miRNA 原理的转基因技术是进行作物改良的有效技术手段之一。其安全性问题同常规的转基因技术一样是社会各界争论的焦点，至今悬而未决。2012 年，Zhang 等[70]研究发现，水稻MIR168a 基因是中国人血清中含量较高的一种植物小RNA，它可以负调控人和小鼠的低密度脂蛋白受体衔接蛋白的mRNA，从而减缓低密度脂蛋白从血浆中的清除。这项研究证明了外源的植物miRNA 可以通过日常摄取食物的方式进入动物的血液和组织器官，并且可通过调控人体内靶基因表达的方式影响人体的生理功能。这项研究结论引发了多方关注。一方面，如果真的存在一种高效的小分子RNA 进入动物体内而实现体内基因表达沉默的方式，将对小分子RNA 传输的治疗手段有重要的意义；另一方面，又让人担心植物miRNA 进入人体内后是否会调控非目标基因而对人体生理产生不良影响。
4 展望在转基因技术的激烈争论中，美国抢占先机，成了转基因产业的全球霸主，其他国家也一直保持着转基因技术的快速发展态势。我国是世界第一人口大国，解决吃饭问题始终是国家的头等大事。目前，推进转基因技术研究与应用是确保国家粮食安全和促进农业生产力的必然要求和重要途径，我国也明确了“积极研究、慎重推广、自主创新”的国家态度。
在近十几年来，miRNA 的研究越来越备受国内外学者的关注。目前，在植物中，大量的miRNA 已被测序和鉴定。随着miRNA 研究手段的不断进步，一些miRNA 在植物体中的生物学功能及分子作用机制也逐渐被阐明。miRNA 具有调控植物适应各种胁迫及生长发育的能力。miRNA 已成为分子生物学领域的研究热点。MiRNA 及其靶基因为利用转基因技术手段进行作物改良提供了新的丰富候选基因资源。国内外学者都希望从中找到作物品种改良的新途径。另外，一些人可能会担忧在转基因植物中改变miRNAs 表达可能导致目标物种中某些基因的非目的调控，使miRNA 转基因作物的商业化和发展也面临风险和挑战[71]。建议要大力加强miRNA 介导的基因调控机制研究，加强序列同源性检测，促进转基因技术的正确设计，降低脱靶效应，并开发组织特异性或诱导型表达策略，更全面的进行实验室和田间试验。基于miRNA 的转基因技术匹配国家风险评估和管理办法，促进植物MicroRNA 介导的基因调控转基因技术在作物改良中的应用得到充分的发展。
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